氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素抗大鼠慢性心力衰竭的實(shí)驗(yàn)研究

，志祿

(1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000;2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院;3保定市第二醫(yī)院)

近年許多研究表明促紅細(xì)胞生成素(EPO)具有心、腦、腎、視網(wǎng)膜等組織器官保護(hù)作用，EPO的衍生物氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素(CEPO)同樣具有組織保護(hù)作用，且無(wú)造血功能，因而大大降低了高血壓、血栓形成等風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生率，但其是否具有抗慢性心力衰竭(CHF)的作用尚未見報(bào)道。2010年3～4月，我們建立大鼠CHF模型，予以CEPO干預(yù)，通過(guò)觀察血流動(dòng)力學(xué)、血清誘生型一氧化氮合酶(iNOS)及超氧化物歧化酶(SOD)等指標(biāo)，探討其是否具有抗CHF的作用及其可能的機(jī)制，為防治CHF提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠90只，購(gòu)自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(200±20)g。室內(nèi)單獨(dú)分籠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用紫外線消毒自來(lái)水，給予標(biāo)準(zhǔn)照明及通風(fēng)條件。

1.2 主要試劑、藥品 NOS(分型)測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)，鹽酸異丙腎上腺素注射液(ISO，上海禾豐藥業(yè)有限公司)，CEPO(Warren Pharmaceuticals公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥 隨機(jī)選取12只大鼠作為對(duì)照組，剩余78只腹腔注射 ISO 5 mg/kg，1次/d，連續(xù)3 d造模［1］，對(duì)照組同期腹腔注射等量生理鹽水。喂養(yǎng)5周后，造模大鼠死亡11只。其中腹腔注射ISO 后第1、2、3天分別死亡5、3、2只，其后喂養(yǎng)期間死亡1只;對(duì)照組大鼠無(wú)死亡。對(duì)存活大鼠進(jìn)行造模成功判定，以左室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg提示CHF模型構(gòu)建成功［2］。剔除造模失敗、術(shù)中意外死亡及術(shù)后死亡大鼠，共有24只大鼠造模成功，隨機(jī)再分為干預(yù)組(n=12)及心衰組(n=12)。干預(yù)組腹腔注射 CEPO 50 μg/kg［3］，2 次/周，持續(xù)4周［4］，心衰組及對(duì)照組同期腹腔注射等量生理鹽水，干預(yù)4周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。CEPO干預(yù)期間，干預(yù)組大鼠無(wú)死亡，心衰組大鼠死亡1只，死因可能為心衰加重，對(duì)照組大鼠死亡1只，經(jīng)解剖檢驗(yàn)死因?yàn)槟c粘連。腹腔注射時(shí)均注意回抽，避免入血管、膀胱及腸管。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 干預(yù)4周后，于最后1次給藥后禁食水12 h，稱重，穿刺右側(cè)頸總動(dòng)脈，并置入內(nèi)含0.1%肝素、直徑1 mm、末端帶有微壓力傳感器的聚乙烯導(dǎo)管，連接BL-410S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括心率(HR)、LVEDP、左室內(nèi)壓峰值(LVSP)、左室內(nèi)壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定完成后，于右側(cè)頸總動(dòng)脈插管處留取血樣本2 ml置于抗凝管中，室溫靜置15 min后，于常溫下3 000 r/min離心10 min，留取上清液，置入－70℃冰箱備用。按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清iNOS、SOD水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用一維方差分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)全程對(duì)照組大鼠飲食正常、行動(dòng)自如、毛色光澤，心衰組及干預(yù)組大鼠先后出現(xiàn)精神不振、活動(dòng)懶散、進(jìn)食減少及毛枯無(wú)澤、散亂豎起等心力衰竭癥狀，嚴(yán)重者還出現(xiàn)脫毛、口唇及足趾發(fā)紺、行走不穩(wěn)等癥狀。但干預(yù)組大鼠CEPO干預(yù)后心衰癥狀較心衰組有所改善。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)變化 見表1。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與心衰組比較，△P ＜0.05

組別 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)－dp/dtmax(mmHg/s)HR(次/min)對(duì)照組 11 140.91±6.83 5.14±1.11 3 963.54±178.83 －3 999.62 ±119.25 329.31 ±12.14心衰組 11 110.52 ±8.85* 20.37 ±1.34* 2 570.86 ±184.12* －3 253.47 ±196.71* 417.17 ±13.23*干預(yù)組 12 125.34 ±8.72＊△ 12.57 ±1.25＊△ 3 062.78 ±149.24＊△ －3 584.53 ±172.86＊△ 390.83 ±12.38＊△

2.3 血清iNOS及SOD水平測(cè)定 與對(duì)照組相比，心衰組及干預(yù)組血清iNOS水平顯著升高(P＜0.05)，而 SOD 水平顯著降低(P ＜0.05);與心衰組相比，干預(yù)組血清iNOS水平顯著降低(P＜0.05)，而SOD水平顯著升高(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清iNOS及SOD水平比較(U/ml，±s)

表2 各組大鼠血清iNOS及SOD水平比較(U/ml，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與心衰組比較，△P ＜0.05

組別 n iNOS SOD對(duì)照組11 8.58 ±0.91 56.80 ±2.62心衰組 11 29.73 ±0.99* 44.16 ±3.88*干預(yù)組 12 21.23±1.49＊△ 50.96±3.43＊△

3 討論

CHF是多種心血管疾病的最終轉(zhuǎn)歸，嚴(yán)重威脅著人類的健康，預(yù)后不良，心衰的5年生存率與惡性腫瘤相仿［5］。因此，防治CHF具有非常重要的意義。CHF的病理生理改變十分復(fù)雜，其中神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂和心室重塑是CHF最主要的發(fā)病機(jī)制，而心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡引起的心肌細(xì)胞丟失及氧自由基(OFR)水平過(guò)高在CHF的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。其中NO除具有血管擴(kuò)張效應(yīng)、抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗血小板聚集和黏附等作用外，還有細(xì)胞毒性及作為炎癥介質(zhì)等作用。在體和離體研究發(fā)現(xiàn)，低濃度NO能增加心肌收縮力，而高濃度NO則抑制心肌收縮力。NO合成的關(guān)鍵酶一氧化氮合成酶(NOS)分為兩型，即原生型一氧化氮合成酶(cNOS)和iNOS。Saito等通過(guò)在大鼠急性心肌梗死模型中應(yīng)用選擇性iNOS抑制劑S-methylisothiourea(SMT)證實(shí)了iNOS在心臟結(jié)構(gòu)和功能方面的負(fù)性作用［6］。cNOS主要參與抑制左室重構(gòu)及左室功能異常［7］。

CHF時(shí)iNOS高度表達(dá)，而cNOS降低，NO水平明顯增高，高濃度NO可損害線粒體能量代謝、抑制細(xì)胞增殖、破壞DNA結(jié)構(gòu)、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡;另外，NO還具有細(xì)胞毒性作用，可以影響細(xì)胞代謝，干擾細(xì)胞呼吸鏈和酶的活性，激活使DNA降解的核酶，從而直接啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而惡化CHF。OFR是機(jī)體內(nèi)一類活潑的不穩(wěn)定基團(tuán)，可與細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。在生理情況下OFR產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡。這種平衡一旦被打破，過(guò)高的OFR水平將會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的受損，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂。尤其是過(guò)高的OFR還可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，暴露內(nèi)皮下膠原，吸引血小板黏附、集聚，并使血管舒張因子合成減少、活性減弱，造成血管過(guò)度收縮，加速CHF的進(jìn)程。而SOD是體內(nèi)清除OFR最主要的酶，其活力的高低間接反映機(jī)體清除OFR的能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CEPO可明顯改善CHF大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，升高LVSP及±dp/dtmax并降低LVEDP及HR。因此，CEPO可以改善CHF大鼠心功能。同時(shí)，CEPO干預(yù)組具有降低血清iNOS水平，升高SOD水平的作用。提示CEPO可能通過(guò)抑制過(guò)度的NO釋放及清除OFR來(lái)改善CHF大鼠的心功能，從而發(fā)揮其抗CHF作用。本研究為治療CHF提供了新的干預(yù)方法和科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)CEPO的新用途奠定了新的理論基礎(chǔ)。

［1］Krenek P，Kmecova J，Kucerova D，et al.Isoproterenol-induced heart failure in the rat is associated with nitric oxide-dependent functional alterations of cardiac function ［J］.Eur J Heart Fail，2009，11(2):140-146.

［2］Tonnessen T，Christensen G，Oie E，et al.Increased cardiac expression of endothelin-1 mRNA in ischemic heart failure in rats［J］.Cardiovasc Res，1997，33(3):601-610.

［3］Fiordaliso F，Chimenti S，Staszewsky L，et al.A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemiareperfusion injury［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(6):2046-2051.

［4］Li Y，Takemura G，Okada H，et al.Reduction of inflammatory cytokine expression and oxidative damage by erythropoietin in chronic heart failure［J］.Cardiovasc Res，2006，71(4):684-694.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)，中華心血管病雜志編輯委員會(huì).慢性收縮性心力衰竭治療建議［J］.中華心血管病雜志，2002，30(1):7-23.

［6］Saito T，Hu F，Tayara L，et al.Inhibition of NOS2 prevents cardiac dysfunction in myocardial infarction and congestive heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(1):339-345.

［7］Jones SP，Greer JJ，Van Haperen R，et al.Endothelial nitric oxide synthase over expression attenuates congestive heart failure in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(8):4891-4896.