低密度脂蛋白受體第 12外顯子基因突變與高膽固醇血癥的關系

張明明，馬 倩，王俊明，帖彥青，宋光耀(河北省人民醫院，石家莊 050051)

研究表明，低密度脂蛋白受體(LDL-R)與血漿膽固醇水平關系密切，該基因異常可導致血漿膽固醇水平顯著上升[1]。LDL-R基因多態性可影響LDL-C、TC水平[2]，但具體突變情況尚不完全明確。本研究采用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性分析技術(PCR-RFLP)結合 DNA直接測序技術對LDL-R基因第 12外顯子 Asp589CysfsX12突變在不同膽固醇水平者的基因和基因型頻率進行了分析。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2008年 12月 ～2009年 12月在我院體檢中心體檢者 1 685例，按照 TC水平分為3組:①高膽固醇血癥組 (HTC組)800例，男 457例、女 343例，年齡(47.61±11.51)歲，TC≥6.22 mmol/L(240 mg/dl);②邊緣高膽固醇血癥組(BTC組)500例，男 286例、女 214例，年齡 (47.16±11.36)歲，5.18 mmol/L＜TC＜6.19 mmol/L(200＜TC＜239 mg/dl);③正常對照組(NC組)385例，男220例 、女 165例 ，TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl)，且 LDL-C＜3.12 mmol/L。血脂異常按 2007年《中國成人血脂異常防治指南》[3]的標準，并排除甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病腎病、腎病綜合征、腎移植術后等影響糖脂代謝的疾病或影響糖脂代謝藥物者。

1.2 方法

1.2.1 血脂測定 入組者空腹12 h，次日晨抽取肘靜脈血 4 ml，分離血清，待測血脂;另取 4 ml置于EDTA抗凝管中，-80℃保存，用于提取 DNA。TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL由 Beckman全自動生化分析儀采用酶法測定。

1.2.2 PCR-RFLP分析 LDL-R基因的多態性 ①基因組 DNA提取:EDTA抗凝血 400μl按照天根血液基因組 DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書提取基因組 DNA。②PCR擴增 LDL-R基因片段:上游引物:5'-GCACGTGACCTCTCCTTATCCACTT-3'，下 游引 物 :5'-CACCTAAGTGCTTGCATCTCGTACG-3'。 PCR反應體系共 20μl，反應條件見參考文獻[4]。③限制性片段多態性分析:PCR產物用限制性內切酶 ClaI進行酶切，反應體系共 20μl，37℃水浴酶切 4 h后終止反應。酶切產物經 8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(100 mV，50 min)，用 UVPGD-8000凝膠圖像分析系統照相、鑒定。

1.2.3 DNA序列分析 PCR擴增產物純化后直接測序(雙向測序)。

1.3 統計學方法 采用 SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，基因頻率采用基因計數法計算;組間基因型與等位基因頻率比較采用 χ2檢驗，危險因素分析采用單因素及多因素 Logistic回歸分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組 BMI、血脂水平比較 見表1。

表1 三組 BMI、血脂水平比較(±s)

表1 三組 BMI、血脂水平比較(±s)

注:與 NC組比較，*P＜0.05;與 BTC組比較，△P＜0.05

組別 n BMI(kg/m2)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)NC組 385 24.11±2.44 4.41±0.55 1.12±0.34 1.29±0.19 2.65±0.43 BTC組 500 26.05±2.97*5.69±0.39* 1.09±0.57 1.07±0.32* 4.12±0.76*HTC組 800 25.41±2.73*8.95±0.89*△1.15±0.37 1.19±0.39*△6.92±0.84*△

2.2 LDL-R基因 Asp589CysfsX12突變基因型情況

2.2.1 PCR-RFLP分型 根據限制性內切酶 ClaI的酶切情況，分為 DD、DC和 CC基因型。PCR產物為 210 bp，DD純合子有酶切位點得到 117、93兩條酶切片段，DC雜合子為 210、179和 159 bp三條片段，CC突變純合子因無 ClaI酶切位點，仍為 210 bp的 1條條帶。見圖1。

圖1 PCR-RFLP分型

2.2.2 DNA序列分析 酶切后取 PCR產物純化后進行雙向測序。Asp589CysfsX12突變位于 LDL-R基因第 12外顯子，第 1 764～1 765位堿基 CG缺失，第 589位氨基酸由 GAT變為 TGT，原有的 ClaI酶切位點(AT↓CGAT)消失。

2.3 LDL-R基因 Asp589CysfsX12突變基因型和等位基因頻率分布 見表2。

表2 LDL-R基因第 12外顯子 Asp 589CysfsX 12突變基因型和等位基因頻率分布[例(%)]

2.4 LDL-R基因 Asp589CysfsX12突變不同基因型間血脂水平的比較 見表3。

2.5 多元線性回歸結果 TC作為因變量(y)，以性別、年齡、BMI、TC、TG、HDL-C、基因型為自變量 ，進行多元線性回歸分析，最后 CC基因型、HDL-C進入方程。回歸方程為:y=0.346(基因型)-0.275(HDL-C)+1.632(P均 ＜0.05)。見表4。

3 討論

表3 LDL-R基因 Asp 589CysfsX 12突變不同基因型間血脂水平的比較(mmol/L，±s)

表3 LDL-R基因 Asp 589CysfsX 12突變不同基因型間血脂水平的比較(mmol/L，±s)

指標 血脂水平DD DC CC F P TC 6.01±1.27 7.22±1.38 9.70±1.75 67.38 ＜0.05 TG 1.00±0.31 1.02±0.30 0.91±0.28 1.04 ＞0.05 HDL 1.19±0.28 1.11±0.30 1.01±0.29 3.48 ＜0.05 LDL 4.51±1.75 5.70±1.61 8.31±2.21 64.58 ＜0.05 VLDL 0.97±0.35 0.91±0.34 0.98±0.29 0.56 ＞0.05

表4 多元回歸分析結果

高膽固醇血癥是心腦血管疾病的獨立危險因素，近年來其發病率逐年上升[5]。LDL-R功能缺陷是引起高膽固醇血癥的重要原因，因此關于 LDL-R功能缺陷的研究已成為目前研究的熱點。本研究在LDL-R基因第 12外顯子中發現了框移突變(1 764～1 765 del，Asp589CysfsX12)，堿基 CG缺失，第 12外顯子 589位密碼子由 GAT變為 TGT，突變部位以后的堿基出現框移，其后氨基酸序列出現錯誤，終止密碼子提前出現，使肽鏈在合成過程中提前中斷。本研究在 HTC組和 BTC組中還發現了 Asp589CysfsX12突變的純合子和雜合子，而正常對照組未發現純合子;同時發現 HTC組的 C等位基因、CC基因型、DC基因型的頻率明顯高于 BTC癥組和 NC組，同時發現血清TC、LDL-C的水平隨 DD、DC、CC基因型的改變有逐漸上升的趨勢，而 HDL-C隨 DD、DC、CC基因型的改變有逐漸下降的趨勢，提示 CC基因型和 C等位基因與血清膽固醇水平的升高有關。多元回歸分析發現，CC基因型是高膽固醇血癥的危險因素，說明LDL-R基因突變與血清膽固醇水平的升高有關，但具體機制有待深入研究。

[1]郭陽，郭津津，劉曉梅，等.低密度脂蛋白受體基因 NcoⅠ、apoCⅢ基因 SacⅠ基因多態性與動脈粥樣硬化腦梗死的關系[J].中國醫科大學學報，2005，34(5):454-456.

[2]Snozek CL，Lagerstedt SA，Khoo TK，et al.LDLRpromoter variant and exon 14 mutation on the same chromosome are associated with an unusually severe FH phenotypeand treatment resistance[J].Eur J Hum Genet，2009，17(1):85-90.

[3]中國成人血脂異常防治指南制定聯合委員會.中國成人血脂異常防治指南[J].中華心血管病雜志，2007，359(5):390-409.

[4]張明明，宋光耀，張新，等.LDL受體基因第 4外顯子 Xsp I位點多態性與高膽固醇血癥的相關性研究[J].中華內分泌代謝雜志，2009，25(1):49-51.

[5]錢偉，錢志遠.高膽固醇血癥的危害與現行對策[J].實用預防醫學，2009，16(2):632-634.