瘦素基因 3′非翻譯區對基因表達的調控作用

毛金媛 ，李英慧 ，單忠艷 ，滕衛平 ，趙彥艷*

(1中國醫科大學附屬第一醫院、遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001;2中國醫科大學)

瘦素(LEP)是由 LEP基因編碼的、167個氨基酸組成的多肽激素，通過與其受體的結合，活化細胞內多條信號轉導通路，在生物體內具有廣泛的生物學功能[1]。人類 LEP(hLEP)基因定位于染色體7q31.3，全長約 16 kD，含有 3個外顯子和 2個內含子，其中包含有 3′非翻譯區(3′-UTR)。研究表明，3′-UTR參與了 mRNA的穩定性、基因表達的定位以及翻譯效率等生理進程的調控。微小 RNA(miRNA)是一類長度 19～25 nt的單鏈非編碼 RNA分子，能與靶基因 mRNA的 3′-UTR結合，在轉錄后負調控基因的表達[2]。2009～2010年，我們觀察了hLEP基因 3′-UTR對基因表達的影響，尤其是 miRNA對 hLEP基因的調控作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒 pGL3-Promoter、pRL-TK購自美國Promega公司，miR-296的表達載體 pre-miRTMhsamir-296 miRNA Precursor(簡寫為 pmiR-296)及 Negative Control(簡寫為 pmiR-NC)購自美國 Ambion公司。T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶均購自美國 NEB公司。感受態大腸桿菌 JM109細胞購自日本 Takara公司。胰蛋白胨、酵母提取物及瓊脂粉購自美國 Sigma-Aldrich公司，DNA凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自德國 Qiagen公司。細胞轉染用脂質體 LipofectamineTM2000為美國 Invitrogen公司產品。雙熒光素酶檢測系統購自美國 Promega公司。人肝癌 Hep G2細胞株為中國醫科大學醫學遺傳學教研室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌 Hep G2細胞常規在DMEM培養基(含 10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)、37℃、5%CO2飽和濕度下培養 24～48 h，0.25%的胰酶消化傳代。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 miRNA的生物信息學預測 利用 miRanda、TargetScan和 PicTar生物信息學軟件預測 hLEP基因(Gene ID:3952)3′-UTR潛在的 miRNA結合位點。站點如下:http://www.microma.org;http://genes.mit.edu/targetscan;http://pictar.bio.nyu.edu。

1.2.3 pGL3-LEP載體的構建 以人 cDNA文庫為模板，通過 PCR方法擴增 hLEP的 3′-UTR片段，上游 引 物:5′-GCTCTAGAGTGCCAAGGTGGGGTATTTA-3′， 下 游 引 物:5′-TGTCTAGAATCTTGTTTCAAAGGGATGTGG-3′，在引物兩端引入 XbaI酶切位點，擴增產物長 210 bp。PCR反應條件:95℃預變性 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環后，72℃延伸 10 min。PCR產物于 l%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察 PCR結果。按 Qiagen說明書純化 PCR產物，將 PCR擴增片段酶切純化后克隆至 pGL3-Promoter熒光素酶編碼基因下游XbaI酶切位點，構建質粒，由 Invitrogen公司測序、確認并鑒定序列插入的正反向，正向插入的命名為pGL3-LEP。

1.2.4 質粒轉染和熒光素酶活性檢測 利用脂質體 LipofectamineTM2000在 24孔板內將熒光素酶報告載體與 miRNA表達載體轉染至 HepG2細胞中，具體方法參照試劑說明書進行。轉染 24 h后，采用Dual-gloTM雙熒光素酶檢測系統檢測熒光素酶的活性。

1.3 統計學方法 采用 SPSS13.0統計軟件，結果以±s表示，組間差異比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hLEP基因 3′-UTR上 miRNA結合位點的預測

利用生物信息學在線軟件，在 hLEP基因 3′-UTR第 1 821位預測到有 1個 miR-296的結合位點，mi-Randa評分為 171，結合能量為 -30.8 kCal/mol。

2.2 構建含有 hLEP基因 3′-UTR的熒光素酶報告載體 為了驗證預測信息的準確性，通過基因重組在 pGL3-Promoter載體(引自 Promega公司《Technical Manual—pGL3 Luciferase Reporter Vectors》)熒光素酶編碼基因下游 XbaI酶切位點插入 hLEP 3′-UTR片段，使其包含有 miR-296的結合位點，構建成熒光素酶報告基因載體 pGL3-LEP。重組質粒經酶切鑒定大小正確，并進一步通過測序證實質粒構建成功。見圖1。

圖1 A:p GL3-LEP的結構示意圖;B:hLEP 3′-UTR片段PCR產物電泳圖

2.3 熒光素酶活性檢測結果 將 pGL3-LEP、pmiR-296或其各自的對照質粒轉染至 HepG2細胞 24 h后發現，與陰性對照組比較，pmiR-296可使 pGL3-LEP的熒光素酶活性下降 50%(P＜0.05)，而對不含有 hLEP基因 3′-UTR的對照質粒 pGL3-Promoter，pmiR-296不影響熒光素酶的表達，說明 miR-296與hLEP基因 3′-UTR存在靶向作用關系，驗證了預測信息的準確性。見圖2。

圖2 熒光素酶活性檢測結果

同時還觀察到，在單獨轉染熒光素酶報告載體時，即不共轉染 pmiR-296或陰性對照組的情況下，pGL3-LEP的熒光素酶活性顯著高于 pGL3-Promoter(P＜0.05)，前者是后者的 1.7倍，提示這段序列可能具有增強子作用。

3 討論

LEP主要是由脂肪細胞分泌的一類肽類激素。LEP基因主要在白色脂肪組織中表達，在棕色脂肪組織中表達較少。其主要功能是調節能量平衡，維持正常體質量。研究表明，LEP與肥胖的發生密切相關，而肥胖又是高血壓、高血脂、糖尿病、非酒精性脂肪肝以及腫瘤等疾病發生的重要因素。許多研究顯示，在上述疾病中血清 LEP水平顯著異常[3，4]。本研究預測并驗證了 miR-296可與 hLEP基因 3′-UTR的特定區域結合，抑制基因的表達，同時 hLEP基因 3′-UTR還具有增強子的作用，這表明 LEP的表達受多方面調控，hLEP基因 3′-UTR在不同水平發揮其調節作用，彼此可能存在相互制約平衡。

hLEP基因 3′-UTR是真核生物 mRNA的重要功能元件，在基因的表達調控、mRNA定位等方面起著重要作用[5]。調控阻遏物與處于 3′-UTR內的順式作用元件結合，可使 mRNA在不同時間得以表達。真核生物 mRNA 3′-UTR大多含有特定的負調控元件，能與反式作用因子相互作用抑制翻譯的進行[6]，尤其是 miRNA，能通過調控基因表達來參與生命過程中的許多重要進程。通過與生物信息學跨種屬的序列對比發現，涉及 3′-UTR的調控元件中接近一半與miRNA有關，人類30%的基因可能受miRNA的調控[7]。

本研究通過生物信息學軟件預測到 hLEP基因3′-UTR中存在 miR-296的潛在結合位點，通過過表達 miR-296觀察到含有 hLEP基因3′-UTR的報告基因表達被抑制，說明 hLEP是 miR-296的靶基因。生物信息學研究顯示，一個 miRNA可以調控約 200個基因，因此 miR-296可能存在多個靶基因，本研究即證實了 miR-296一個新的靶基因。

本研究還發現，hLEP基因 3′-UTR可以增強基因的表達，有增強子的作用，與 Palmer等[8]報道Snail基因 3′端含有增強子類似。這種增強子發揮作用的方式可能有兩種:①3′-UTR也存在類似 5′端序列的順式反應元件，通過與反式因子結合調控基因表達;②可能是通過遠隔交互作用與基因的 5′端發生聯系從而影響基因的轉錄。其具體作用機制還需要進一步研究證實。

肥胖正在成為全球日益嚴峻的公共衛生問題，LEP的異常表達不但與肥胖的發生密切相關，而且與肥胖相關的各種代謝性疾病密不可分，因此調控LEP的表達對于這些疾病的防治具有重要意義。

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