索拉菲尼聯(lián)合華蟾素對離體肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的協(xié)同抑制效應(yīng)觀察

鄭培實，張 陽，蔣 葵，李英華，徐麗葉，方立萍，丁曉蕾

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧大連 116023)

目前，對于晚期肝癌仍缺少有效的藥物治療方案[1]，以細(xì)胞信號傳導(dǎo)為理論基礎(chǔ)的靶向治療是近期研究熱點。研究證實，索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一是通過 RAF/MEK/ERK通路[2]，而華蟾素通過 FAS通路起到抗腫瘤作用[3]。但目前療效欠佳，其根本原因在于信號通路的交叉[4]。解決方案為發(fā)現(xiàn)不同通路的結(jié)點(即 Crosstalk)[5]和可能存在的信號增益。以此為理論基礎(chǔ)即可實現(xiàn)不同靶點藥物的合理聯(lián)合，又有可能深化信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識，并發(fā)現(xiàn)更多可以利用的結(jié)點。2009年 10月 ～2010年 4月，我們將索拉非尼聯(lián)合華蟾素作用于人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞，探討兩藥聯(lián)合潛在的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。華蟾素注射劑，索拉非尼。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。Mcl-1單克隆抗體，Tubulin多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG和羊抗兔 IgG，PVDF膜。RPMI1640培養(yǎng)液(含 10%胎牛血清、青鏈霉素各100 U/ml)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，細(xì)胞為上皮樣貼壁細(xì)胞，每 3 d傳代 1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)及相關(guān)指標(biāo)檢測 將對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞接種于 96孔板，密度為 7×103/孔，培養(yǎng) 24 h后分成四組，索拉非尼組予索拉非尼6.0μmol/L干預(yù)，華蟾素組予華蟾素 0.6μmol/L干預(yù)，聯(lián)合組予索拉非尼和華蟾素聯(lián)合干預(yù)(劑量同前)，對照組不做任何干預(yù)。各組均設(shè) 5個復(fù)孔，加藥分別培養(yǎng) 24、48 h后行以下指標(biāo)檢測:①細(xì)胞增殖抑制率:各孔加 5%四氮唑藍(lán)液 10μl，孵育 4 h，洗滌后各孔加二甲基亞砜 200μl，充分混勻溶解，酶標(biāo)儀測定波長 570 nm處的 D值，計算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(對照組 D值 -實驗組 D值)/對照組 D值 ×100%。②細(xì)胞凋亡率:離心去培養(yǎng)基，PBS洗滌后，采用 Annexin.V/PI雙標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)避光室溫標(biāo)記30 min，流式細(xì)胞儀檢測。③Mcl-1 mRNA:加藥培養(yǎng) 48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA，采用 RT-PCR法檢測。于 Light Cycler RT-PCR System儀上行定量 RT-PCR;結(jié)果以 Mcl-1拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)計算 Mcl-1 mRNA的表達(dá)。④Mcl-1蛋白:加藥培養(yǎng) 48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白，采用 Western blot法檢測。結(jié)果用 Leica Qwin圖像分析軟件進(jìn)行條帶光密度積分值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示。兩組間比較采用 F檢驗，多組間比較采用單因素方差分析;交互效應(yīng)分析采用因子分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率 各組不同時間細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

表1 各組不同時間細(xì)胞增殖抑制率(%)

2.2 細(xì)胞凋亡率 華蟾素組 24、48 h后凋亡率分別為 3.27%、4.35%;索拉非尼組分別為 12.31%、4.62%;聯(lián)合組分別為 19.01%、7.33%，聯(lián)合組與單藥組比較明顯升高(P均 ＜0.05)。

2.3 Mcl-1 mRNA及蛋白表達(dá) 見表2。

表2 各組 Mcl-1 mRNA及蛋白表達(dá)(%)

3 討論

晚期肝癌缺少有效的治療手段，利用 RAF/MEK/ERK通路[5]或FAS通路[6]以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前研究熱點。索拉非尼是第一個口服的多激酶抑制劑，作用機(jī)制之一即在于激活 RAF/MEK/ERK通路[6，7]。已有多項研究證實華蟾素對離體肝癌細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，且其作用機(jī)制在于激活 FAS通路[8，9]。本研究結(jié)果表明索拉非尼單藥、華蟾素的單藥和聯(lián)合均能抑制 SMMC-7721細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。統(tǒng)計學(xué)分析顯示兩藥聯(lián)合有交互效應(yīng)，且為協(xié)同作用。這一結(jié)果提示索拉非尼與華蟾素聯(lián)用，可能取得較兩藥單用更好的療效。

為進(jìn)一步闡明這種協(xié)同作用的分子機(jī)制，我們檢測了兩種藥物單獨作用及聯(lián)合作用情況下對Mcl-1蛋白及 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明聯(lián)合組的 Mcl-1蛋白表達(dá)水平最低;索拉菲尼使 Mcl-1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，而華蟾素僅使 Mcl-1蛋白表達(dá)顯著降低，提示上述協(xié)同作用可能在于索拉菲尼放大了華蟾素作用下的 FAS通路的信號，而非相反。值得注意的是，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但索拉菲尼下調(diào) Mcl-1蛋白的程度確實大于華蟾素，說明索拉菲尼很可能發(fā)揮著獨立于 RAF/MEK/ERK通路的、引起了 Mcl-1蛋白降解增加的作用。鑒于已經(jīng)證實的 Mcl-1蛋白的降解分子通路[10]，可印證索拉菲尼對于肝癌 SMMC-7721細(xì)胞的這一潛在作用在于對 Caspase-3的影響，與 Huber等[11]基于慢性淋巴細(xì)胞白血病的觀察中得出的結(jié)論相符。

為突破靶向治療療效欠佳的瓶頸問題，方案之一是更精確地了解受體表達(dá)情況(藥敏檢測)。但鑒于細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路之間存在的交叉[4]，即使實現(xiàn)了一條通路的成功阻斷，信號也可以通過旁路傳導(dǎo)而使預(yù)計的療效無法實現(xiàn)。因此有理由認(rèn)為:發(fā)現(xiàn)不同通路的結(jié)點來發(fā)揮有利的信號增益可能是另一種更可行的解決方案[5]。本研究結(jié)果證實索拉菲尼與華蟾素通過 RAF和 FAS雙通路干預(yù)及 Mcl-1這一結(jié)點發(fā)揮了協(xié)同抑制作用，機(jī)制在于索拉菲尼通過對華蟾素作用下 FAS通路的信號放大作用而上調(diào)了離體肝癌細(xì)胞的凋亡，這可以為上述藥物在臨床上的合理聯(lián)合提供理論基礎(chǔ);另一方面表明索拉非尼可能具有影響肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721的 Mcl-1蛋白降解能力，其上游事件值得進(jìn)一步研究。

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