關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射醫(yī)用臭氧對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的影響及最佳濃度探討

庾俊雄，徐 恒，譚永星，鄒國耀

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林 541001)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是中老年人常見病，目前臨床多以藥物和物理療法治療，且效果多不滿意[1]。臭氧具有較強(qiáng)的消炎、止痛作用，有資料表明關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射臭氧對 OA有治療作用[2]。2010年，我們觀察了醫(yī)用臭氧對 OA關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液中 NO的影響，探討其治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8個月齡健康大耳白兔 32只，雌雄不拘，體質(zhì)量 2.0～2.5 kg。隨機(jī)分為空氣組及臭氧低、中、高劑量組各 8只。各組分籠飼養(yǎng) 1周適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實驗。一氧化氮(NO)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，醫(yī)用臭氧發(fā)生器，為德國赫爾曼公司產(chǎn)品。

1.2 OA模型的建立及干預(yù) 每組右膝關(guān)節(jié)均按Hulth法[3]復(fù)制出膝骨性關(guān)節(jié)炎(OA)模型:麻醉后，從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切斷兔右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶和前后交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。自造模日起，每日上午驅(qū)趕動物活動 15 min，共 4周;左膝關(guān)節(jié)作為對照。4周后空氣組右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入空氣 2 ml，臭氧低、中、高劑量組分別予膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射 25、40、80 μg/ml醫(yī)用臭氧 2 ml，1次/周 ，共 4周 。

1.3 相關(guān)指標(biāo)檢測 ①膝關(guān)節(jié)活動度 :分別于造模前、造模成功后及處死動物前采用量角器測量膝關(guān)節(jié)屈伸最大角度，每膝關(guān)節(jié)測量 3次，取其平均值。②關(guān)節(jié)軟骨病理改變:治療完成 3 d后將動物麻醉后固定，抽取 1 ml生理鹽水注入右膝關(guān)節(jié)腔，充分活動膝關(guān)節(jié)后抽出關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體、暴露膝關(guān)節(jié)腔，大體觀察股骨髁和脛骨平臺，于股骨髁內(nèi)側(cè)小心取軟骨組織 3 mm×3 mm，厚約 0.5 mm，置入 10%中性甲醛溶液內(nèi)固定，石蠟包埋。肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨色澤、表面光滑度、纖維化、糜爛潰瘍或骨贅形成發(fā)生情況;HE染色觀察關(guān)節(jié)軟骨表面是否規(guī)則、潮線是否完整、軟骨細(xì)胞排列是否規(guī)則、軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨表層纖維性成分多少等;甲苯胺藍(lán)(TB)染色觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量，TB著色情況和潮線的完整性。使用 Mankin′s評分[4]評估軟骨損傷情況，分?jǐn)?shù)越高說明軟骨損傷越重。③關(guān)節(jié)液中 NO表達(dá)檢測:將關(guān)節(jié)腔灌洗液稀釋后，采用硝酸還原酶法測定 NO含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS18.0統(tǒng)計軟件。所有計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對樣本 t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)活動度 各組右膝關(guān)節(jié)活動度比較見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)活動度比較(n=8，°，±s)

表1 各組膝關(guān)節(jié)活動度比較(n=8，°，±s)

注:與造模前比較，*P＜0.01;與造模成功時比較，△P＜0.05

組別 造模前 造模成功時 處死前即刻A組 162.1±4.9 106.1±3.3* 104.5±2.6 B組 162.5±3.9 106.0±2.6* 148.9±4.2△C組 161.5±3.3 102.9±3.1* 135.4±2.1△D組 160.8±5.1 104.9±2.6* 129.3±3.4△

2.2 膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變 肉眼觀察:左膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，淡藍(lán)色半透明狀，軟骨邊緣無骨贅形成。右膝空氣組軟骨表面粗糙，表面橫縱裂隙不規(guī)則，關(guān)節(jié)面糜爛潰瘍，內(nèi)髁軟骨邊緣有少量骨贅形成，低劑量組軟骨表面較光滑，顏色較暗，可見關(guān)節(jié)面糜爛，較少見潰瘍，中、高劑量組軟骨表面粗糙呈顆粒狀，裂紋及糜爛較低劑量組多見。光鏡下觀察:空氣組軟骨表面粗糙不規(guī)則，裂隙較多，軟骨纖維細(xì)胞增多，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，臭氧低劑量組軟骨表面較規(guī)則，裂隙及纖維細(xì)胞較空氣組減少，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，散在分布，排列尚整齊，TB染色輕度減退，中、高劑量組軟骨細(xì)胞明顯減少，排列紊亂，有簇樣增生，潮線不完整，TB染色中、重度減退。空氣組和臭氧低、中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨的Mankin評分分別為(7.6±0.5)、(4.9±0.6)、(5.5±0.5)、(6.9±0.8)分。與空氣組比較，臭氧低、中、高劑量組右膝關(guān)節(jié)軟骨 Mankin評分降低(P＜0.05)，其中低劑量組 Mankin評分降低程度最大。

2.3 關(guān)節(jié)液 NO含量 空氣組和臭氧低、中、高劑量組 NO含量分別為(139.0±10.4)、(96.8±9.8)、(109.5±13.1)、(116.5±16.1)μmol/L，均明顯高于左膝的(34.1±3.4)μmol/L(P均 ＜0.05);與空氣組比較，臭氧低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)液中 NO含量明顯降低(P＜0.05)，其中低劑量組降低程度最大。

3 討論

近年來的研究顯示，NO在 OA的病理發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。關(guān)節(jié)內(nèi) NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化生成。NOS有兩種亞型，包括結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶(cNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)。iNOS介導(dǎo)產(chǎn)生的 NO對組織有損傷作用，其通過間接表達(dá)促炎癥因子使 OA病變持續(xù)，抑制膠原蛋白和蛋白聚糖合成及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而cNOS介導(dǎo)產(chǎn)生的 NO對組織有疼痛緩解作用，且能減少 iNOS和 OA病理過程中產(chǎn)生 NO的有害作用。NO作用是雙重而復(fù)雜的[5，6]。OA時膝關(guān)節(jié)的正常力學(xué)軸線被破壞，關(guān)節(jié)最大壓力承受面由外側(cè)脛骨平臺轉(zhuǎn)至內(nèi)側(cè)脛骨平臺與股骨內(nèi)側(cè)髁，加之切斷交叉韌帶引起的關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，局部關(guān)節(jié)軟骨所承受的壓力相對增加，從而使軟骨發(fā)生變性。

關(guān)節(jié)軟骨分泌的 NO在 OA發(fā)生時生成增加，過量的 NO可抑制基質(zhì)合成，促進(jìn)基質(zhì)降解;由于與超氧化物陰離子等氧化劑的反應(yīng)，NO促使細(xì)胞損傷，使軟骨細(xì)胞對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡更敏感[7]。在體外實驗中，人滑膜纖維母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時無NO產(chǎn)生，當(dāng)加入 IL-1β、TNF-α等后可活化其中的iNOS，產(chǎn)生大量 NO。IL-1β通過 NO促使人軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，而 NOS抑制劑可抑制IL-1β誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。

臭氧治療 OA的機(jī)理可能為臭氧通過刺激氧化酶過度表達(dá)，抗炎和抑制免疫性反應(yīng)，擴(kuò)張血管、改善回流，促進(jìn)炎癥因子和 NO的吸收;還可直接作用于神經(jīng)末梢，刺激抑制性中間神經(jīng)元釋放腦啡肽等物質(zhì)，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。目前臭氧治療 OA的最佳濃度尚無定論。本研究結(jié)果顯示，25μg/ml醫(yī)用臭氧能改善 OA模型兔膝關(guān)節(jié)的活動度，降低關(guān)節(jié)液內(nèi)NO濃度，對減輕 OA的關(guān)節(jié)軟骨損傷也有一定作用，提示 25μg/ml醫(yī)用臭氧可改善 OA模型兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境和關(guān)節(jié)運(yùn)動功能。而 40、80μg/ml臭氧注入關(guān)節(jié)腔后僅膝關(guān)節(jié)活動度明顯改善，但其病理學(xué)檢查與 25μg/ml者比較并無明顯改善，可能是由于臭氧強(qiáng)大的氧化作用，使關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原氧化，影響軟骨細(xì)胞和基質(zhì)的增殖能力。而臭氧對兔膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的遠(yuǎn)期作用及臨床療效的評價，還需要進(jìn)行更加深入的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，三種濃度的臭氧均能減輕 OA的炎癥反應(yīng);但 40、80μg/ml濃度時可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞，應(yīng)引起臨床重視。

[1]肖曉山.膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的治療進(jìn)展[J].中國臨床康復(fù)，2003，7(29):3996-3997.

[2]Bocci VA.Scientific and medical aspects of ozone therapy state of the art[J].Arch Med Res，2006，37(4):425-435.

[3]Hulth A，Lindberg L，Telhag H.Experimental osteoarthritis in rabbits:preliminary report[J].Acta Orthop Scand，1970，41(5):552.

[4]Kuroki H，Nakagawa Y，Mori K，et al.Acoustic stiffness and change in plug cartilage over time after autologous osteochondral grafting:correlation between ultrasound signal intensity and histological score in a rabbit model[J].Arthritis Res Ther，2004，6(6):492-504.

[5]Hancock CM，Riegger-Krugh C.Modulation of pain in osteoarthritis:the role of nitric oxide[J].Clin J Pain，2008，24(4):353-365.

[6]Abramson SB.Osteoarthritis and nitric oxide[J].Osteoarth Cart，2008，16(Suppl 2):15-20.

[7]Scher JU，Pillinger MH，Abramson SB.Nitric oxide synthases and osteoarthritis[J].Curr Rheumat Rep，2007，9(1):9-15.