RP-HPLC法測定清肺抑火丸中芒果苷的含量

張麗珍，周之榮（廣東藥學院，廣州市 510006）

清肺抑火丸是由黃芩、梔子、知母、浙貝母、黃柏等10味藥材制成的中藥成方制劑，具有清肺止咳、化痰通便之功效。臨床用于治療痰熱阻肺所致的咳嗽、痰黃稠黏、口干咽痛、大便干燥。該產品現行標準[1]采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷的含量，有文獻報道薄層掃描法測定清肺抑火丸中小檗堿和菝葜皂苷元的含量[2]和HPLC法測定白花前胡甲素[3]及大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種蒽醌類成分的含量[4]，但芒果苷的含量測定未見文獻報道。為進一步評價該制劑的質量，筆者建立了清肺抑火丸中芒果苷含量測定的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并證明該法具有分離效果好、靈敏、準確等優點，可用于清肺抑火丸的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀、Agilent 1100系列雙元泵、Agilent 1100可變波長檢測器、Agilent 1100/化學工作站（美國安捷倫公司）；KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，工作頻率100 kHz，輸出功率400 W）。

芒果苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111607-200402）；清肺抑火丸（甘肅佛仁制藥科技有限公司，批號：20100702、20100901、20100704、20100501、20090504，規格：每袋6 g）；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取芒果苷對照品10.2 mg，置于100 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（芒果苷濃度為102 μg·mL－1）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取清肺抑火丸適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，續濾液0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取處方組成中除知母外的其余成分，制成不含知母的陰性對照，按“2.1.2”項下的制備方法處理，作為陰性對照溶液。

2.2 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國迪馬公司）；流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（13∶87）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：258 nm；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。分別取對照品溶液（芒果苷濃度為25.5μg·mL－1）、供試品溶液和陰性對照溶液10μL，注入HPLC儀。結果，理論板數以芒果苷峰計算≥6000；芒果苷峰的拖尾因子為0.95，保留時間約為16.5 min，芒果苷峰與其他組分峰的分離度＞1.5；陰性對照不干擾樣品測定。色譜見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別吸取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL的芒果苷對照品貯備液，加稀乙醇稀釋成芒果苷濃度為5.1、10.2、20.4、25.5、30.6、40.8、51.0 μg·mL－1的溶液。依次進樣10μL，每個濃度測定3次以上。以峰面積（A）對對照品溶液系列濃度（C）進行回歸，得回歸方程A＝42.11C－16.06（r＝0.9997）。結果表明，芒果苷檢測濃度在5.1～51.0 μg·mL－1范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取濃度為25.5μg·mL－1的芒果苷對照品溶液10μL，連續測定5次。結果，其峰面積的平均值為1074.0，RSD＝0.39%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取供試品溶液（批號：20100702）于0、2、4、6、8、12 h 分別進樣10 μL，記錄峰面積。結果，芒果苷峰面積的平均值為956.0，RSD＝1.47%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批號（20100702）樣品適量，共6份，按“2.1.2”方法提取、“2.2”項下方法測定。結果，芒果苷平均含量為1.170 mg·g－1，RSD＝0.54%，表明本方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批號（20100702）樣品適量，共6份，加入相應量的芒果苷對照品，照“2.1.2”方法處理并按照“2.2”項下方法測定，計算回收率。結果，芒果苷平均加樣回收率為99.6%，RSD＝1.33%，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tset（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取清肺抑火丸樣品5批，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液（25.5μg·mL－1）與供試品溶液各10μL，注入HPLC儀，按照“2.2”項下方法測定，計算樣品中芒果苷的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

知母是百合科植物知母的干燥根莖，為2010年版《中國藥典》收載的常用中藥之一，味甘、苦，性寒，入肺、胃、腎經，具有清熱瀉火、生津潤燥之功，為方中主藥。其化學成分主要有甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、有機酸類、生物堿、黃酮類、多糖類、微量元素及大量的黏液質等[5]，其中芒果苷是知母中主要的雙苯吡酮類成分，含量可達0.7%[6]，具有抗炎和減輕哮踹作用、抗病毒和抗腫瘤作用、抗氧化作用、免疫調節作用[7]，因此筆者將芒果苷作為清肺抑火丸含量測定的指標性成分。

本試驗曾考察了不同的提取溶劑（甲醇、乙醇、三氯甲烷）、不同提取方法（回流、超聲）、不同的超聲提取時間（20、30、40、50、60 min）對芒果苷含量的影響。結果表明，稀乙醇超聲提取30 min，直接過濾制備的供試品溶液，芒果苷的提取率高、分離效果好。

芒果苷具有一定的弱酸性。試驗中考察了不同比例的乙腈-磷酸水溶液對分離的影響，結果發現乙腈-磷酸水溶液（13∶87）為流動相，能實現芒果苷與其他組分的有效分離，芒果苷峰形好，分離度＞1.5。試驗還發現柱溫對芒果苷分離測定影響較大，在室溫下測定結果不穩定，當柱溫選擇35℃時，得到滿意結果。因此，選用如前所述的色譜條件。

綜上所述，本試驗采用RP-HPLC法中的離子抑制色譜法測定芒果苷的含量，方法學驗證表明，其精密度、穩定性、加樣回收率和重復性均能滿足定量的要求。故本方法可用于清肺抑火丸的質量控制，建議相關標準升級時增加芒果苷的含量測定。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1116.

[2]衛恒巧，李作平，崔秀彥，等.薄層掃描法測定清肺抑火丸中小檗堿和菝葜皂苷元的含量[J].河北醫科大學學報，1992，（4）：199.

[3]黃瑞紅，楊慧文.RP-HPLC法測定清肺抑火丸中白花前胡甲素的含量[J].中國藥房，2010，21（27）：2556.

[4]葉秀金，宋粉云.HP LC法測定清肺抑火丸中大黃的四種成分的含量 [J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：646.

[5]李習平，石繼連，胡還甫.知母的研究概況[J].岳陽職業技術學院學報，2010，25（1）：90.

[6]楊麗榮.知母的化學成分及藥理作用研究進展[J].國外醫學中醫中藥分冊，2002，24（4）：207.

[7]王穎異，郭寶林，張立軍.知母化學成分的藥理研究進展[J].科技導報，2010，28（12）：110.