HPLC-MS/MS法測定人血漿中氯法拉濱的濃度

朱寶英，趙立波，王茜，張春燕，陳欣，黃靜，方翼#b（1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴陽市 550004；.北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京市 100044）

氯法拉濱是第2代嘌呤核苷酸類似物[1]，可用于治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）[2，3]。其作為一種新型的抗癌藥，既能抑制脫氧核糖核酸（DNA）聚合酶，使DNA合成終止，又能抑制核苷酸還原酶，從而終止DNA鏈的延長及修復(fù)。該藥于2005年1月在美國上市，對急性白血病尤其有效，作為近10年來首個(gè)獲準(zhǔn)專門用于治療兒童白血病的新藥，主要用于治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性ALL，是目前唯一專門用于兒童急性白血病的化療藥[4]，國內(nèi)尚無相關(guān)制劑上市。目前有關(guān)氯法拉濱血藥濃度的測定方法，國外報(bào)道不多[5～7]，國內(nèi)也僅見1篇報(bào)道[8]。本研究旨在應(yīng)用近年來迅速發(fā)展的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧（HPLC-MS/MS）檢測技術(shù)，建立一種簡便、靈敏、快速、準(zhǔn)確的人血漿中氯法拉濱濃度的定量分析方法，以滿足氯法拉濱藥動(dòng)學(xué)研究的需要。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜包儀，包括G1312A型二元輸液泵、G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1379B型脫氣機(jī)（美國Agilent公司）；AB SCIEX QTRAP5500型三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（Turbo Ionspray）、Analyst1.5.1分析軟件（美國Applied Biosystems公司）；Vortex-2 GENIE渦旋混合器（美國Scientific Industrics公司）；MD 200 Sample concentiator型氮吹儀（北京晨曦科創(chuàng)科技發(fā)展公司）；Anketdl-40B型普通離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Ministart plus型微型高速離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）；KH-600E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；GM-50（天津騰達(dá)過濾器件廠）；CPA225D型萬分之一天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

氯法拉濱對照品（批號：20100709）、克拉屈濱對照品（內(nèi)標(biāo)，批號：AP-010-B101202）、噴司他汀對照品（穩(wěn)定劑）均為浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司提供；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚、甲酸、乙酸銨為色譜純，水為Direct-Q?超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（250∶3，其中含4 mmol·L－1的乙酸銨和0.3% 的甲酸）；流速：0.5 mL·min－1；進(jìn)樣量：10 μL；每個(gè)樣品的分析時(shí)間：5 min。

電噴霧離子源：正離子掃描；噴霧口位置：3∶5；Gas 1：35.0 Psi；Gas 2：70.0 Psi；氣簾氣壓力：35.0 Psi；碰撞氣壓力：Medium；離子源電壓：4500.0 V；離子源溫度：600℃；多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描分析，用于定量氯法拉濱和克拉屈濱的離子反應(yīng)分別為m/z 304.2→170.0，m/z 286.1→170.0。

在該色譜及質(zhì)譜條件下，考察6個(gè)來自不同個(gè)體的質(zhì)譜圖，空白血漿、對照品加入到空白血漿中和受試者服藥后的血漿樣品色譜圖見圖1。

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 氯法拉濱工作溶液：準(zhǔn)確稱取氯法拉濱對照品適量，加入少量甲醇溶解并定容，配成濃度為1 mg·mL－1的貯備液1，并從中取出少量稀釋并定容，配成濃度為100 μg·mL－1的貯備液2。將貯備液2用流動(dòng)相稀釋成系列工作溶液供分析用。

圖1 液-質(zhì)圖譜A.質(zhì)譜圖；B.空白血漿；C.對照品+空白血漿；D.受試者服藥后的血漿樣品Fig 1 HPLC-MS/MSA.MS；B.blank plasma；C.standard control+blank plasma；D.blood sample of patients

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)克拉屈濱對照品適量，用甲醇溶解并定容，配成濃度為1 mg·mL－1的貯備液3，并從中取出少量用甲醇稀釋并定容，配成濃度為100 μg·mL－1的貯備液4。從貯備液4中取適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為1 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

將以上所有溶液置于4℃冰箱保存待用。

2.3 樣品預(yù)處理

精密量取含噴司他汀10 μmol·L－1的空白血漿200 μL，置于7.0 mL塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg·mL－1克拉屈濱）渦旋混勻1 min，然后加入提取劑甲基叔丁基醚3.0 mL，渦旋混勻10 min，4000 r·min－1離心5 min 后，取上清液2.6 mL，40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤肓鲃?dòng)相200 μL 復(fù)溶，渦旋混勻3 min，13400 r·min－1離心5 min 后，取上清液10 μL 進(jìn)樣分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取含噴司他汀10 μmol·L－1的空白血漿200 μL，分別加入不同濃度的氯法拉濱工作溶液20 μL，使血漿中氯法拉濱濃度分別為2.5、5、10、20、50、100、200、500 ng·mL－1，所有樣品按“2.3”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜。以氯法拉濱與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）對氯法拉濱濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y＝0.0138X－0.000545（r＝0.9999），權(quán)重因子W＝1/X2。結(jié)果表明，氯法拉濱血藥濃度在2.5～500 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為2.5 ng·mL－1。

2.5 精密度及方法回收率試驗(yàn)

分別配制濃度為5、50、200 ng·mL－1的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，進(jìn)樣分析，考察氯法拉濱日內(nèi)精密度及方法回收率；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。方法回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

加入量/ng·mL-1 550200日間RSD/%4.0913.9411.07測得量/ng·mL-1 4.77±0.2649.09±3.29197.00±13.19方法回收率/%95.6498.8399.23日內(nèi)RSD/%4.774.475.64

2.6 基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率的考察

取含噴司他汀的空白血漿200 μL于離心管內(nèi)，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，氮?dú)獯蹈珊螅謩e用濃度為 5、50、200 ng·mL－1的氯法拉濱標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL復(fù)溶，每個(gè)濃度配置5份樣品，取10 μL進(jìn)樣分析，以得到色譜峰面積A與同樣濃度的氯法拉濱標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積B的比值，考察基質(zhì)效應(yīng)。另分別配制濃度為5、50、200 ng·mL－1的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，進(jìn)樣分析得到血漿樣品中氯法拉濱的峰面積C，C/A×100%即為提取回收率。結(jié)果表明，氯法拉濱低、中、高3種濃度的基質(zhì)影響的RSD分別為9.93%、5.76%、11.38%。可見，該方法基質(zhì)效應(yīng)小，具有特異、專一地測定分析物質(zhì)的能力。氯法拉濱低、中、高3種濃度提取回收率分別為81.79%、66.03%、77.40%，相應(yīng)的RSD分別為12.02%、5.75%、4.80%。

2.7 樣品穩(wěn)定性考察

配制濃度為5、50、200 ng·mL－1的血漿樣品各3份，分別將處理前、后的2批樣品置于室溫下放置24 h，將另一批樣品反復(fù)凍融3次后，均按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，當(dāng)日隨行雙標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察樣品穩(wěn)定性。樣品穩(wěn)定性結(jié)果見表2。

表2 樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of stability tests of samples（n＝3）

2.8 方法應(yīng)用

測定了3位靜脈滴注氯法拉濱（52 mg·m－2·d－1）2 h的白血病患者（已簽署知情同意書）給藥前及給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。1名白血病患者注射氯法拉濱后的藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 1名白血病患者注射氯法拉濱后的藥-時(shí)曲線Fig 2 Plasma concentration-time curve of clofarabine in a leukemia patient after the injection of clofarabine

3 討論

據(jù)外文文獻(xiàn)報(bào)道[6]，樣品處理的方法采用乙腈沉淀蛋白法，考慮到沉淀法處理的樣品雜質(zhì)較多，故本試驗(yàn)采用液液提取法處理樣品。另外文獻(xiàn)報(bào)道[8]采用乙酸乙酯提取法處理血漿，本試驗(yàn)則比較了乙酸乙酯、乙醚和甲基叔丁基醚3種溶劑分別作為提取劑的提取效果，結(jié)果甲基叔丁基醚整體效果較好，故選用甲基叔丁基醚提取法處理血漿。因此，本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8]所定線性范圍為2.5～500 ng·mL－1，使檢測結(jié)果更靈敏、準(zhǔn)確。

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