HPLC法測定臍帶血中頭孢美唑鈉濃度及其在剖宮產產婦中的預防用藥研究

王玨，魏 媛，段京莉，倪君君，熊 歆，張現化（.北京大學第三醫院藥劑科，北京市 009；2.北京大學醫學部藥學院，北京市 009；3.北京大學第三醫院婦產科，北京市 009；.北京國立柏林醫學科技發展有限公司，北京市 009）

頭孢美唑鈉是一種半合成的頭霉素衍生物，抗菌性能與第2代頭孢菌素相近。大量臨床試驗表明[1，2]，該藥對革蘭陽性及陰性菌均具有良好的抗菌效能，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、脆弱擬桿菌以及厭氧菌也有良好的抗菌活性，且對各種β-內酰胺酶有很強的耐受性和穩定性，可用于預防婦科、腹腔、泌尿道、呼吸道、皮膚及軟組織等部位的感染。目前，頭孢美唑鈉廣泛用于行剖宮產的產婦手術預防用藥，由于頭孢美唑鈉可透過胎盤屏障進入胎兒血循環，而尚無數據表明本藥在胎兒中的安全性，因此對頭孢美唑鈉在臍帶血中的濃度進行測定，可以幫助考察藥物對胎兒的影響。本研究建立了測定臍帶血中頭孢美唑鈉濃度的方法，并成功地應用于臨床使用頭孢美唑鈉預防感染的剖宮產產婦。

1 材料

1.1 儀器

1100高效液相色譜儀，包括脫氣機、泵、自動進樣器、G1321A柱溫箱和紫外檢測器（FLD）（美國Agilent公司）；GB 204型電子天平（瑞士Mettler公司）；純水系統（美國Millipore公司）；TG16W臺式高速離心機（長沙易達儀器）；MS3 digital渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.2 試藥

頭孢美唑鈉對照品（第一三共制藥（上海）有限公司，批號：JPA0444，純度：98%）；注射用頭孢美唑鈉（第一三共普樂發株式會社，批號：JPA04639-11，規格：1 g）；內標：對乙酰氨基酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100018-200408，含量：99.69%）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），并配有Agilent Eclipse XDB-C184-Pack預柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.026 mol·L－1醋酸銨（pH 6.0）-甲醇（85∶15）；紫外檢測波長：273 nm ；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2.2 標準溶液的配制

準確稱取1 g頭孢美唑鈉對照品，加純水5 mL溶解，搖勻后即得濃度為200 mg·mL－1的頭孢美唑鈉對照品母液，置冰箱4℃保存備用。取一定量母液加純水，使之成為含頭孢美唑鈉2.5、5、10、40、100、250、500、1000 g·mL－1的系列標準溶液。

2.3 血漿樣品處理

精密取血漿100 μL于1.5 mL離心管中，精密加入內標（100 μg·mL－1對乙酰氨基酚）溶液10 μL，混勻后加入甲醇300 μL，于渦旋混合器上混合2 min沉淀蛋白，再置于高速離心機以12000 r·min－1離心10 min ，取上清液100 μL于另一離心管中，加入純水100 μL稀釋，混勻后進樣分析。

2.4 專屬性考察

在“2.1”項色譜條件下，頭孢美唑鈉的保留時間約為12.8 min，內標的保留時間約為5.4 min。結果表明，藥物、內標峰峰形較好，與雜質峰分離效果好，空白血漿中的內源性物質不干擾頭孢美唑鈉及內標的色譜分析。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+500 μg·mL－1頭孢美唑鈉標準溶液+內標Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+500 μg·mL－1cefmetazole sodium+internal standard

2.5 標準曲線的制備

精密吸取系列頭孢美唑鈉標準溶液各10 μL，置于1.5 mL離心管中，加入空白血漿90 μL，制備成頭孢美唑鈉濃度為2.5、5、10、40、100、250、500、1000 μg·mL－1的血漿標準品，按“2.3”項下步驟操作并進行色譜分析，記錄色譜。以頭孢美唑鈉濃度（c）為橫坐標，頭孢美唑鈉峰面積與內標峰面積的比值（A）為縱坐標作圖，得線性回歸方程為A＝0.017c+0.083（r＝0.9994）。結果表明，頭孢美唑鈉血藥濃度在2.5～1000 μg·mL－1范圍內線性關系良好，定量下限為2.5 μg·mL－1（測得值為（2.565±0.083）μg·mL－1，RSD為3.24%）。

2.6 精密度試驗

配制含頭孢美唑鈉5、100、700 μg·mL－1的低、中、高3種濃度的血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法操作并進樣分析。在不同天內連續制備并測定3個分析批，每批樣品3個濃度水平，每個濃度5份樣品，計算日內、日間RSD。測定結果表明，血漿樣品分析的精密度、準確度良好，結果見表1。

2.7 回收率試驗

表1 精密度及回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

按“2.6”項下方法配制低、中、高3種濃度的頭孢美唑鈉血漿樣品各5份，再于1.5 mL離心管中加入血漿90 μL和甲醇300 μL，渦旋2 min，12000 r·min－1離心10 min，按“2.3”項下方法操作并進樣分析，并計算方法回收率。另以血漿樣品頭孢美唑鈉峰面積與相應對照品溶液頭孢美唑鈉峰面積之比求算提取回收率，結果，血漿樣品平均提取回收率為95.70%（RSD＝4.58%）。精密度及回收率試驗結果見表1。

2.8 穩定性試驗

配制低、中、高3種濃度的頭孢美唑鈉血漿樣品，每個濃度4份，每份5個樣品。第1份立即按“2.3”項下方法操作；第2份室溫放置24 h后，按“2.3”項下方法操作，考察頭孢美唑鈉血漿樣品在室溫條件下的穩定性；第3份反復凍融3次，按“2.3”項下方法操作，考察頭孢美唑鈉在凍融條件下的穩定性；第4份在－20℃的條件下冷凍1個月，按“2.3”項下方法操作，以考察其凍存穩定性。結果顯示RSD均＜9%（見表2），表明頭孢美唑鈉血漿樣品在室溫放置、冷凍儲存及反復凍融情況下均穩定。

表2 頭孢美唑鈉血漿樣品穩定性考察結果（n＝5）Tab 2 Results of stability tests of cefmetazole sodium in plasma samples（n＝5）

2.9 臨床應用

11名患者均為北京大學第三醫院婦產科2010年7－10月住院行剖宮產術的產婦。術前單次給予注射用頭孢美唑鈉2 g，靜脈滴注0.5 h，于給藥后不同時間點取臍帶血于抗凝管中，用高效液相色譜（HPLC）法測定臍帶血中頭孢美唑鈉濃度，結果見表3。

表3 11例剖宮產產婦取血時間及血藥濃度Tab 3 Blood sampling time and plasma concentration in 11 patients with cesarean section

3 討論

3.1 測定方法的優化

本研究建立了測定人血漿中頭孢美唑鈉濃度的HPLC法，并進行了系統的方法確證，結果表明該方法穩定性良好，符合生物樣品分析的要求。

在建立本定量分析方法時，本研究對流動相的pH值、流動相組成的比例、紫外檢測波長等分析條件進行了優化。流動相醋酸銨和甲醇的比例為85∶15，醋酸銨pH值為6.0，此結果是在參考相關文獻的基礎上[3～7]，通過測定組分的不同比例，并以醋酸調節其pH值，考察其不同條件下目標成分及內標的峰形和保留時間進行優化而得。另外分別測定了頭孢美唑鈉在213、254、273 nm波長下的紫外吸收情況，為最大限度地提高其響應值，最終選定273 nm為檢測波長。

本研究建立的方法操作簡便、回收率高、專屬性強、穩定性好，結果準確、靈敏、快速，為檢測頭孢美唑鈉的血藥濃度提供了簡單可行的方法，還可用于頭孢美唑鈉的治療藥物監測和藥動學的研究。

3.2 臨床應用

剖宮產切口屬于Ⅱ類切口，手術主要感染病菌為革蘭陰性桿菌，多使用第2代頭孢菌素。頭孢美唑鈉療效與第2代頭孢菌素類似，且具有頭孢菌素類藥物抗菌譜較廣、療效肯定、價格低廉的優點[8]。

研究表明[9]，健康成年人靜脈滴注注射用頭孢美唑鈉1 g 1 h后，血藥濃度在滴注結束時達峰值，峰平均值為76.2 μg·mL－1，6 h后為2.7 μg·mL－1，血藥濃度半衰期為1.2 h左右，藥物濃度和給藥劑量成正相關。另有一項由高瀨善次郎等[8]進行的靜脈注射1 g頭孢美唑鈉后30 min～6 h測定母血和臍帶血濃度研究中，母體血清中的藥物濃度在給藥后30 min達峰，平均峰值為98 μg·mL－1；臍帶血清在2 h后達峰，峰值為12.25 μg·mL－1。表明母體血清和臍帶血清中的藥物濃度達峰時間存在1.5 h的時間差，從峰值的比率來看，母體血清濃度有12.5%滲透至臍帶血清中。

本項研究中頭孢美唑鈉給藥劑量為2 g，滴注時間為30 min。剖宮產術時胎兒娩出時間普遍為開始用藥后的15～20 min，此時臍帶血中頭孢美唑鈉濃度約為10～16 μg·mL－1。與文獻相比，血藥濃度僅相當于母體濃度的7%～10%。從11例剖宮產產婦不同時間點所取血測得的結果可以看出（見表3），臍帶血中的頭孢美唑鈉濃度大約在45 min～1 h左右達到峰值，約23～25 μg·mL－1。因藥物濃度與給藥劑量成正相關，此結果與文獻中給予1 g藥物靜脈滴注時的峰濃度值12.25 μg·mL－1一致，約相當于母體血峰值的12%。還需注意的是，嚴重腎功能損害者可能會出現血藥濃度升高、半衰期延長。本項研究中的患者腎功能均無異常，而對于腎功能不全的剖宮產產婦要慎重用本藥，適當調節給藥劑量和間隔。

雖然頭孢美唑鈉被證實是一種療效較好的藥物，尤其是其對β-內酰胺酶有很好的穩定性[10，11]，然而隨著耐藥性革蘭陰性桿菌的逐漸增加，有必要進行更加深入的臨床研究，以確立本藥對新生兒和產婦的安全性。

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[2]王月芳，胡金蓉.頭孢美唑鈉預防剖宮產圍手術期感染的臨床研究[J].西部醫學，2010，22（7）：1255.

[3]邊 原，何 林，夏祺悅.反相高效液相色譜法測定注射用頭孢美唑鈉的含量[J].中國藥業，2010，19（5）：26.

[4]關日睛，莫履強.高效液相色譜法測定先鋒美他醇[J].廣東藥學，1994，4：120

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