白附子混懸液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用的免疫調節機制研究*

于曉紅，宋 娜，胡艷文

（1.黑龍江中醫藥大學微生物學與免疫學教研室，哈爾濱 150040；2.天津市塘沽區婦幼保健院，天津 319000)

白附子混懸液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用的免疫調節機制研究*

于曉紅1，宋 娜1，胡艷文2

（1.黑龍江中醫藥大學微生物學與免疫學教研室，哈爾濱 150040；2.天津市塘沽區婦幼保健院，天津 319000)

[目的]研究白附子混懸液對荷瘤小鼠免疫功能的調節作用，探討其抗腫瘤作用的免疫學機制。[方法]采用H22荷瘤小鼠模型為研究對象，用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測小鼠血清中白介素-2（IL-2）和白介素-4（IL-4）水平；用流式細胞術（FACS）法分析對CD4+，CD8+T細胞的調節作用。[結果]白附子混懸液能夠上調荷瘤小鼠血清IL-2細胞因子的表達，降低IL-4水平，可以使CD4+T細胞表達升高，CD8+T細胞表達降低。[結論]白附子混懸液能夠通過調節荷瘤機體異常免疫功能狀態而發揮抗腫瘤作用。

白附子混懸液；H22細胞；免疫調節

白附子，為天南星科多年生草本植物獨角蓮（Typhonium giganteum Engl）的塊莖。產于河南、甘肅、湖北、黑龍江等地。味微辛，性溫，有毒，歸胃，肝經。具有祛風痰、燥濕、定驚、散結止痛之功效，外用治瘰疬痰核[1]。白附子的化學成分及藥理作用近年來已有報道，主要含有脂肪酸、甾體類化合物、揮發油成分、氨基酸和微量元素等。白附子的藥理學作用主要有抗炎、鎮靜、抗驚厥、止痛，并對多種惡性腫瘤具有一定的抑瘤效果[2－5]。白附子治療各種腫瘤在民間廣為應用，但目前尚無對其抗腫瘤作用的免疫調節機制的研究報道[6]。前期研究表明白附子混懸液（SGTR）通過體內免疫調節抗腫瘤，抑瘤率可達

39.14%。在前期研究的基礎上，本課題組進一步對白附子混懸液抗腫瘤的免疫調節機制進行深入研究分析，為研制一新型抗腫瘤輔助藥物提供現代免疫學資料。

1 實驗材料和方法

1.1 動物 選用健康昆明種小鼠（KM），（20±2.0）g（6～8周齡），雌雄各半，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心。許可證號：黑醫實驗動物單項準第61號。

1.2 H22瘤株 由哈爾濱醫科大學腫瘤研究所提供。

1.3 藥物及試劑

1.3.1 藥物 1）白附子鮮品購于黑龍江省五常市，經黑龍江中醫藥大學生藥實驗室專家鑒定為天南星科植物獨角蓮的塊莖。去須、洗凈、切成約2mm的厚片，經60℃烘干粉碎，過80目篩，臨用時以雙蒸餾水溶解成不同濃度（按倍比稀釋法）。2）環磷酰胺注射液（CTX），由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，產品批號：06111521。

1.3.2 試劑 抗CD4-藻紅蛋白（PE）和抗CD8-異硫氰酸熒光素（FITC）單抗，小鼠白介素-2（IL-2）試劑盒和小鼠白介素-4（IL-4）試劑盒（為深圳晶美生物工程有限公司產品）。

1.4 儀器 酶聯免疫檢測儀（anthos 2010 17750，Austria）；微量加樣器（SOCOREX，瑞士）；FACSCALIBUR流式細胞儀（BD公司,美國）；電熱恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；低溫超速離心機（KDC-160HR，安徽，合肥）等。

1.5 動物模型的制備 無菌取第8天轉移癌H22腹水（計活細胞大于95%），用0.9%生理鹽水稀釋成2×106個/mL，取健康純系昆明種小鼠40只，18～22 g（6周齡），雌雄各半，每只鼠右側腋部皮下接種0.2mL瘤細胞懸液，然后將荷瘤鼠按照隨機數字表法隨機分為4組，每組10只（雌雄各半），分別為模型組、實驗組、環磷酰胺組和聯合用藥組，另取10只未接種荷瘤的小鼠（雌雄各半）作為正常對照組。

1.6 動物分組及給藥方法 正常對照組：生理鹽水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理鹽水0.2mL；模型組：生理鹽水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理鹽水0.2mL；實驗組：白附子混懸液[825mg/（kg·d）]灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理鹽水0.2mL；環磷酰胺組：生理鹽水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射CTX[30 mg/(g·d)]0.2 mL；聯合用藥組：白附子混懸液[825mg/（kg·d）]灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射CTX[30mg/（kg·d）]0.2mL。

以上各組均從實驗第2天開始給藥，每日1次，連續10 d。稱質量后，眼球取血，頸椎脫臼處死，以75%乙醇浸泡消毒后剝離瘤組織。

1.7 測定方法

1.7.1 小鼠外周血IL-2水平的測定 原理：酶標雙抗體夾心法。1）小鼠眼球取血，置于離心管中，分離血清（3 000 r/min，離心 5min）。2）從密封袋中取出所需板條，平衡至室溫。3）除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品（每孔100μL）加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育90min，洗板4次。4）除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（每孔100μL）。封住板孔，37℃孵箱孵育60min，洗板4次。5）除空白孔外，加入酶結合物工作液（每孔100μL）。封住板孔，37℃孵箱孵育 30 min，洗板4次。6）加入顯色劑（每孔100μL），避光37℃孵箱顯色15min，加入終止液（每孔100μL），混勻后即刻測量OD492值（5min內）。

1.7.2 小鼠外周血IL-4水平的測定 實驗原理、方法基本同于IL-2測定。

1.7.3 流式細胞術（FACS）法測定T淋巴細胞CD4+和CD8+細胞亞群 取抗凝血100μL放于試管中，分別加入抗CD4-藻紅蛋白（PE）和抗CD8-異硫氰酸熒光素（FITC）單抗各 10μL，置室溫避光 20min，加入紅細胞裂解液2mL，離心棄上清液，加磷酸鹽緩沖液（PBS）洗液2mL混勻，離心后棄上清液，加入固定液600μL，4℃存放至少30min后，流式細胞儀測定。

2 實驗結果

2.1 白附子混懸液對H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4的影響 見表1。模型組與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。實驗組與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01），結果接近正常對照組水平（P>0.05）。環磷酰胺組的IL-2水平與模型組比較無統計學意義（P>0.05），與正常組比較差異有統計學意義（P<0.01）；而 IL-4水平低于模型組（P<0.01），表明CTX（環磷酰胺注射液）對荷瘤小鼠IL-2的表達無明顯調節作用，且有較強的抑制作用。聯合用藥組IL-2水平與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01），與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.01），說明兩藥合用后能夠調節機體的免疫狀態，降低CTX(環磷酰胺注射液)的免疫抑制作用，但尚不能使IL-2水平得以完全糾正。

表1 白附子混懸液對H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4 的影響（±s）Tab.1 Effectsof SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearingm ice（±s）

表1 白附子混懸液對H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4 的影響（±s）Tab.1 Effectsof SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearingm ice（±s）

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01。

組別 n正常對照組 10模型組 10實驗組 10環磷酰胺組 10聯合用藥組 10 IL-2（ng/L） IL-4（ng/L）164.47±10.95 101.36± 6.21 114.68±11.09** 133.21±10.22**158.10± 8.66▲▲ 99.80± 7.56▲▲112.48±11.25** 93.97± 4.77▲▲130.95±15.11**▲▲ 94.88± 6.69▲▲

2.2 白附子混縣液對H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+細胞的影響 見表2。模型組與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。實驗組與模型組比較差異，有統計學意義（P<0.01），結果接近正常對照組水平（P>0.05），能夠使 CD4+細胞回升，CD8+細胞有所回落，明顯改善CD4+/CD8+的失衡狀態。環磷酰胺組與正常對照組和模型組比較差異均有統計學意義（P<0.01），CD4+細胞、CD8+細胞均明顯降低。聯合用藥組的CD8+細胞水平接近正常對照組（P>0.05），CD4+細胞水平與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.01），說明兩藥合用能夠部分改善環磷酰胺的抑制作用，調節機體CD4+/CD8+失衡狀態。

表2 白附子混懸液對H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+細胞的影響（±s）Tab.2 Effectsof SGTR on blood CD4+，CD8+cells in H22 tumor bearingm ice（±s）

表2 白附子混懸液對H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+細胞的影響（±s）Tab.2 Effectsof SGTR on blood CD4+，CD8+cells in H22 tumor bearingm ice（±s）

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01。

組別 n正常對照組 10模型組 10實驗組 10環磷酰胺組 10聯合用藥組 10 CD4+細胞 CD8+細胞 CD4+/CD8+46.09±2.07 22.62±1.68 2.05±0.22 40.00±1.65** 28.86±1.58** 1.39±0.09 45.19±0.90▲▲ 24.00±1.24▲▲ 1.92±0.11 37.17±1.52**▲▲ 17.92±1.22**▲▲ 2.08±0.15 40.62±1.89** 22.64±2.31▲▲ 1.81±0.23

3 討論

荷瘤小鼠外周血T細胞亞群比例出現異常，表現為CD4+T細胞減少，CD8+T細胞增多，這些變化可以通過CD4+/CD8+比值得到更敏感的反映。即荷瘤機體CD4+/CD8+比值下降，小鼠機體免疫功能減弱。CD4+T細胞可分化為TH1細胞和TH2細胞，其誘導因素有：由感染引發的細胞因子[主要是干擾素（IFN）-γ、IL-12和IL-4]、啟動免疫應答的協同刺激信號以及肽-主要組織相容性復合物（MHC）的性質。IL-4可促進CD4+T細胞分化成TH2。模型組荷瘤小鼠IL-2水平明顯下降，IL-4水平明顯升高，說明荷瘤小鼠免疫功能處于紊亂狀態，TH2細胞相對處于優勢地位，抑制了抗腫瘤特異性免疫應答TH1細胞的優勢狀態。

用白附子混懸液治療后，能使荷瘤小鼠CD4+T細胞表達增加，CD8+T細胞表達降低，可以明顯改善CD4+/CD8+比值的失衡狀態，恢復機體正常的免疫狀態，從而發揮抗腫瘤的作用。同時白附子混懸液能夠促進荷瘤小鼠IL-2的表達，使IL-4水平有所下降，使荷瘤小鼠的IL-2、IL-4水平接近正常對照組，說明白附子混懸液能夠促進荷瘤小鼠TH1型細胞因子的表達，使荷瘤小鼠由TH2型細胞因子優勢狀態向TH1型逆轉，糾正TH1/TH2漂移，從而增強荷瘤機體的細胞免疫功能，提高荷瘤機體的抗腫瘤能力。

白附子混懸液與CTX合用后，CD4+細胞、CD8+細胞均有所回升CD8+細胞水平接近正常對照組，說明兩藥合用能夠部分改善CTX對荷瘤小鼠的細胞免疫抑制作用，調節機體CD4+/CD8+的失衡狀態。同時能使IL-2表達水平提高，說明兩藥合用后能夠調節荷瘤機體的免疫狀態，降低CTX對荷瘤小鼠細胞免疫的抑制作用，但尚不能使IL-2水平得以完全糾正。

綜上，白附子混懸液可以改善荷瘤機體CD4+/CD8+的失衡狀態，促進IL-2等TH1型細胞因子的表達，糾正荷瘤機體TH1/TH2漂移，提高荷瘤機體的細胞免疫功能而發揮抗腫瘤效應。

[1]孫 燕，趙 平.臨床腫瘤學進展[M].北京：中國協和醫科大學出版社，2005：3－8.

[2]詹啟敏.分子腫瘤學[M].北京：人民衛生出版社，2005：66－104.

[3]姜文奇，張曉實，朱孝峰.腫瘤生物治療學[M].廣州：廣東科學技術出版社，2006：4－7.

[4]陳丙英，陳子興.分子生物學基礎與臨床[M].福州：東南大學出版社，2000：15-30.

[5]張天澤，徐光煒.腫瘤學[M].天津：天津科學技術出版社，2005:825.

[6]于曉紅，梅 蕾，顏培宇，等.山核桃樹枝水煎劑對荷瘤鼠P53和PCNA 基因表達的影響[J].天津中醫藥，2007，24（5）：399－401.

The immuneadjustmentmechanism ofanti-tumor efficacy of SGTR on H22tumor bearingm ice

YUXiao-hong1,SONGNa1,HUYan-wen2
(1.DepartmentofMicrobiology and Immunology,Heilongjiang University of TCM,Harbin 150040,China;2.Maternaland Child Health Hospitalof Tianjin Tanggu District,Tianjin 319000,China)

[Objective]Study the adjustment function of SGTR on the immune system of tumor-bearingmice and investigate the immunologicalmechanism of the inhibition function ofSGTR on tumor’sgrowth.[Methods]H22tumorbearingmicewere as the research object.Wemeasured the levels of IL-2 and IL-4 in serum with ELISA method,and the influence of SGTR on CD4+、CD8+T cell with FACS method.[Results]SGTR can improve the expression of IL-2 cytokines in H22tumorbearingmice's serum,lower the levelof IL-4,increase the expression ofCD4+T cells,and reduce the expression ofCD8+T cells in H22tumorbearingmice.[Conclusion]SGTR could play a role ofanti-tumoractivity by regulating the body’sabnormal immune function in tumor-bearing state.

SGTR;H22cells;immune regulation

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0326-03

黑龍江省科技攻關計劃項目（GOOC201301）。

于曉紅（1958-），女，教授，碩士研究生導師，主要從事中醫藥抗腫瘤的免疫學研究。

2011-04-26）