Smad4基因沉默對胰腺上皮內瘤變細胞基因表達譜影響的初步研究*

朱 蘭 柳茂森 楊純英王 琪蔣 荷姚靜靜王立夫#

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院消化內科1（200025） 浙江省臺州市中心醫院消化內科2

近年，胰腺癌前病變胰腺上皮內瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN）中的異常分子遺傳學事件逐漸受到關注[1]。Kras基因第12位密碼子突變是胰腺癌發生、發展中的主要早期事件，而Smad4基因突變是主要晚期事件[2]。Smad4基因屬抑癌基因，可抑制胰腺癌細胞增殖[3]。本課題組的前期研究成功構建了 LoxP-Stop-LoxP-KrasG12D；Pdx1-Cre PanIN模型（第l2位甘氨酸突變為天冬氨酸），分離并建立了早期PanIN細胞株[4,5]，并以RNA干擾技術成功沉默PanIN細胞的Smad4基因以獲取PanIN-S細胞株。本研究以PanIN細胞和PanIN-S細胞為研究對象，應用小鼠全基因表達譜芯片篩查兩種細胞的基因表達譜差異，探討Smad4基因沉默致PanIN細胞增殖和惡性轉化的可能分子機制。

材料與方法

一、細胞株、主要試劑、儀器和基因芯片

PanIN細胞株為Kras基因突變小鼠基因打靶胰腺 PanIN 模型（LoxP-Stop-LoxP-KrasG12D；Pdx1-Cre小鼠[4]）經體外建株獲得，基因突變分析示PanIN細胞可檢測到KrasG12D突變，但無p16、p53、Smad4等基因突變或缺失[5]。采用RNA干擾技術，慢病毒介導PanIN細胞內源性Smad4基因沉默以建立PanIN-S細胞株。

Trizol（Invitrogen 公 司 ），RNeasy MiniKit（Qiagen 公司），aa-UTP（Ambion 公司），Cy3 NHS ester（GE Healthcare 公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq （TaKaRa 公司），Low RNA InputFluorescentLinearAmplification Kit、Gene Expression Hybridization Kit、Gene Expression Wash Buffer Kit、Stabilization and Drying Solution、Microarray GasketSlide Kit、Microarray Hybridization Chamber Kits、2100生物分析儀、G2565BA微陣列掃描儀（Agilent公司）。

Agilent小鼠 4×44 K全基因表達譜芯片由上海伯豪生物技術有限公司提供，每張芯片代表小鼠基因組中所有已知基因和轉錄本，約含41174個小鼠基因和轉錄本。PanIN細胞和PanIN-S細胞各使用三張芯片。

二、方法

1.提取并純化總 RNA：Trizol提取細胞總RNA，260 nm和280 nm處測定吸光度（A）值以確定樣品濃度和純度。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，2100生物分析儀行質檢，RNeasy Mini Kit純化總RNA。

2.aa-UTP標記cRNA：采用第一鏈和第二鏈一步法逆轉錄合成cDNA，以cDNA第二鏈為模板體外轉錄合成cRNA并行aa-UTP標記。RNeasy Mini Kit純化cRNA。

3.cRNA樣品熒光標記和純化：測定cRNA濃度，取 4μg cRNA 濃縮至 6.6μl，加入 DMSO 10μl、碳酸氫鈉（0.3 mol/L，pH 9.0）3.4μl以制備 cRNA混合液。取20μl混合液加入熒光染料（Cy3 NHS ester）25℃孵育1 h進行標記。加入hydroxylamine（4 mol/L） 9μl混勻，25 ℃孵育 15 min。 RNeasy Mini Kit純化cRNA。

4.芯片雜交和洗滌：取55μl混合液，60℃溫浴30 min 行片段化，加入 55μl緩沖液。取 100μl混合液上芯片，10 r/min 65℃滾動雜交17 h，芯片洗滌。

5.芯片檢測和分析：微陣列掃描儀行芯片掃描，GeneSpring GX 10生物芯片數據分析軟件行結果分析，并行Quantile均一化處理。標準化后的信號值行差異倍數比較，篩選出差異倍數＞2的基因點。

6.實時熒光定量RT-PCR驗證差異表達基因：Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA。目的基因PCR引物由BioTNT公司合成（見表1）。PCR反應體系為25μl。反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個循環。目的基因表達量的分析采用 2-ΔΔCt法。

三、統計學分析

結 果

一、RNA質量鑒定

總 RNA A260/A280 比值為 1.91～2.02，l%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳可觀察到清晰的18 S和28 S條帶，說明RNA質量良好，無降解。

二、基因芯片篩選結果分析

基因芯片掃描圖像背景均一，各點間距均勻相等，所獲圖像整體背景較低，信噪比較高。變異系數為2.44%～4.10%（變異系數在15%左右表示實驗成功，越小表示重復性越好）。基因芯片雜交結果示差異倍數＞2的基因共237個，其中148個基因在PanIN-S細胞中表達上調，89個基因表達下調，差異表達基因主要涉及細胞周期、增殖、凋亡、黏附、轉錄活性等。

表1 目的基因PCR引物序列和擴增片段大小

進一步對細胞周期相關基因，包括細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）1、CDK2、CDK4、CDK6、細胞周期蛋白（cyclin）A、cyclin B、cyclin D、cyclin E、CDK 抑制劑 p15、p16、p18、p19、p21、p27 等進行篩選，結果示PanIN細胞與PanIN-S細胞的p27、p19、cyclin D1基因表達存在顯著差異，差異倍數分別為 0.38、0.36 和 2.11。

三、基因芯片篩選結果驗證

實時熒光定量RT-PCR結果示PanIN細胞與PanIN-S細胞間 p27、p19、cyclin D1基因表達存在顯著差異（P<0.05），差異倍數均值分別為0.41、0.39和1.82（見圖1），與基因芯片篩選結果一致。

圖1 兩組細胞p27、p19和cyclin D1相對表達量比較（實時熒光定量RT-PCR）

討 論

抑癌基因 Smad4是轉化生長因子-β（TGF-β）信號轉導途徑中的關鍵分子，TGF-β/Smad4信號轉導途徑可通過阻斷細胞周期的G1/S期轉換，促進細胞凋亡。文獻報道PanIN和胰腺癌的Smad4基因突變率約為50%，而其他腫瘤中的突變率通常＜10%，提示Smad4基因是PanIN和胰腺癌較特異的抑癌基因[6]。

本課題組的前期研究采用RNA干擾技術沉默Smad4基因表達，體外實驗證實在Kras基因突變啟動的PanIN細胞中沉默Smad4基因可促進PanIN細胞的惡性轉化，但其具體機制尚未闡明。PanIN-S細胞增殖細胞核抗原（PCNA）陽性表達率顯著高于PanIN細胞，提示Smad4基因缺失聯合Kras基因突變可顯著促進PanIN細胞增殖，且有進展為胰腺導管腺癌的可能[6]。

本研究通過基因芯片技術檢測PanIN細胞和PanIN-S細胞的基因表達譜差異，結果示兩組細胞涉及細胞周期、增殖、凋亡、黏附、轉錄活性等的237個基因出現差異表達，其中與細胞周期相關的差異表達基因包括p27、p19、cyclin D1，實時熒光定量RT-PCR驗證結果與基因芯片篩選結果一致，由此提示細胞周期相關基因p27、p19、cyclin D1表達異常可能參與了PanIN-S細胞的增殖和惡性轉化。

p27基因又稱CDKN1B，其編碼蛋白屬Cip/Kip家族，可與CDK2競爭性結合，致cyclin A-CDK2、cyclin E-CDK2、cyclin B-CDK2等復合體形成受抑，以阻止細胞從G2期進入M期。Shiraso等[7]的研究證實p27kip1過表達可明顯抑制膽管癌細胞生長。Chen等[8]的大樣本病例對照研究發現，p27基因突變人群發生胰腺癌的概率明顯高于普通人群。p19基因又稱CDKN2D，其編碼的CDK抑制蛋白可通過與CDK4或CDK6競爭性結合抑制cyclin D-CDK4或cyclin D-CDK6復合體形成，從而阻止細胞從G1期進入S期。Ulanet等[9]的研究發現p19基因缺失可經p53依賴和p53非依賴性途徑促進腫瘤細胞增殖。本研究結果示PanIN-S細胞的p27、p19表達顯著低于PanIN細胞，提示Smad4基因沉默可抑制p27、p19表達，推測前者可能通過促進cyclin B-CDK2復合體形成，使細胞從G2期進入M期；后者可能通過促進cyclin D-CDK4復合體形成，使細胞從G1期進入S期，由此促進腫瘤細胞增殖。

cyclin D1可促進細胞增殖，作為細胞周期中短暫出現的基因表達產物，具有嚴格的周期順序性，可與特定CDK結合形成復合體，以促進細胞從G1期進入S期，其過表達可縮短G1期，減少細胞對生長因子的依賴，故可導致細胞持續分裂和增殖。Halilovic等[10]的研究發現PIK3CA基因突變可修復cyclin D1，致腫瘤細胞持續增殖。Radulovich等[11]的研究發現cyclin D3為胰腺癌細胞周期原始啟動子，cyclin D1和cyclin D3可協同促進胰腺癌細胞的有絲分裂。本研究結果示PanIN-S細胞cyclin D1表達增加，推測Smad4基因沉默可促進cyclin D1表達，通過與CDK2、CDK4形成復合體，使細胞進入S期，由此促進腫瘤細胞增殖。

綜上所述，本研究通過基因芯片技術篩選并經實時熒光定量RT-PCR驗證發現Smad4基因沉默可致PanIN細胞的細胞周期相關基因p27、p19和cyclin D1表達發生明顯改變，這可能是其參與PanIN-S細胞增殖和惡性轉化的機制之一。對差異表達基因的深入研究有助于闡明多基因調控網絡在胰腺癌發生中的作用，從而為胰腺癌的診斷和治療提供新的線索。

1 王琪,王立夫.小鼠胰腺腫瘤模型的研究進展.內科理論與實踐,2010,5(6):507-510.

2 Koorstra JB,Feldmann G,Habbe N,et al.Morphogenesis of pancreatic cancer:role of pancreatic intraepithelial neoplasia (PanINs).Langenbecks Arch Surg,2008,393(4):561-570.

3 Yasutome M,Gunn J,Korc M.Restoration of Smad4 in BxPC3 pancreatic cancer cells attenuates proliferation without altering angiogenesis.Clin Exp Metastasis,2005,22(6):461-473.

4 Hingorani SR,Wang L,Multani AS,et al.Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.Cancer Cell,2005,7(5):469-483.

5 王立夫,Tuveson DA.Kras突變小鼠胰腺癌前病變PanIN細胞的生物學特性.中國癌癥雜志,2006,16(8):651-657.

6 齊曉光,慎睿哲,王立夫,等.Smad4基因沉默促進PanlN裸鼠移植瘤增殖和微血管形成的研究.中國癌癥雜志,2009,19(7):485-490.

7 Shiraso S, Katayose Y, Yamamoto K, et al.Overexpression of adenovirus-mediated p27kip1 lacking the Jab1-binding region enhances cytotoxicity and inhibits xenografted human cholangiocarcinoma growth.Anticancer Res,2009,29(6):2015-2024.

8 Chen J,Amos CI,Merriman KW,et al.Genetic variants of p21 and p27 and pancreatic cancer risk in non-Hispanic Whites:a case-control study.Pancreas,2010,39(1):1-4.

9 Ulanet DB,Hanahan D.Loss of p19(Arf)facilitates the angiogenic switch and tumor initiation in a multi-stage cancermodelvia p53-dependentand independent mechanisms.PLoS One,2010,5(8):e12454.

10 Halilovic E,She QB,Ye Q,et al.PIK3CA mutation uncouples tumor growth and cyclin D1 regulation from MEK/ERK and mutant KRAS signaling.Cancer Res,2010,70(17):6804-6814.

11 Radulovich N,Pham NA,Strumpf D,et al.Differential roles ofcyclin D1 and D3 in pancreatic ductal adenocarcinoma.Mol Cancer,2010,9:24.