預處理激光照射足三里穴對白細胞減少癥的免疫調節影響

舒天麗 楊華元

(上海中醫藥大學，上海市浦東新區蔡淪路1200號，201203)

中醫針灸學是中華民族幾千年來防病治病經驗的結晶，它在治未病方面有著絕對的優勢，早在《黃帝內經》中就已經提到“上工治未病”。免疫機能正常與否是決定機體的健康或疾病的關鍵，如果免疫機能正常就可以“防未病”“調欲病”“治已病”。影響機體免疫功能下降具有多種因素，如環境衛生、藥物影響、社會和工作壓力，以及個人的衣食住行、生活方式等。穴位激光照射法對免疫功能低下疾病的治療，具有無痛、無菌、安全、易于臨床施治、對于年老體弱和懼針者更為適宜的優勢。預處理的治療方式在改善和提高免疫功能低下的同時，在其他方面也有諸多優勢，如減少醫療費用和藥物對機體的毒副作用等，并可提高治療后的康復速度，所以探索有效的提高免疫功能的預處理治療方法，是當今重要的醫學研究課題，也是中醫治病救人的預防醫學精神的體現。

1 實驗材料

新西蘭種雄性大白兔20只，體重(2.8±0.2)kg，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證編號:SCXK(滬)2009-0018，于上海寶牧實驗動物養殖場購買;上海中醫藥大學實驗設施使用許可證編號:SYXK(滬)2009-0069。所有動物在同等標準環境內養育，給以自然飲水和飲食，適應實驗環境1周。根據體重將兔編號，按照SAS9.0產生的隨機數字表將20只兔隨機分為2組，穴位照射預處理組(預處理組)和假照射對照組(對照組)，每組10只。

2 實驗方法

2.1 試劑和儀器 環磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)(0.2g)，購自德國Baxter Oncology GmbH公司。自行研制一臺2路810nm低強度10mW激光照射治療儀。810nm低強度、持續波激光通過光纖輸出聚合照射于穴位。激光輸出端與動物皮膚之間距離始終保持實驗過程中干預的一致性。2路激光照射治療儀保持雙側足三里穴同時照射45s的一致性。

2.2 造模 穴位照射預處理組實驗共15d，包括造模前預處理治療、造模、造模后假照射3個階段:第1～5d進行造模前干預，提高機體免疫功能，干預方法為激光(波長 810nm，功率 10mW，持續波)同時照射雙側足三里穴［1］2 次/d，45s/次(4J/cm2)，2 次照射間隔時間3h;第6～10d進行動物造模，造模方法參照文獻［2］，2組通過兔耳緣靜脈注射環磷酰胺復制白細胞(WBC)減少癥模型。每0.2g環磷酰胺加10mL生理鹽水。75%乙醇棉球消毒兔耳緣皮膚，將環磷酰胺溶液(2.5mL/kg體重)緩慢推入兔耳緣靜脈，隔天注射，共3次，讓兔體重減輕，身體虛弱，WBC計數正常范圍為7×109～13×109/L，直至WBC數量下降至低于注射前的60%，并能保持5～6d白細胞減少癥的現象，作為造模成功的標志。第11～15d進行造模后假激光照射，將激光置于雙側足三里穴，但不進行照射(2次/d，45s/次，2次間隔時間 3h)。對照組實驗共 10d，包括造模、造模后假照射2個階段:第1～5d動物造模，方法同預處理組;6～10d進行假激光照射。2組照射前及隨后3h測量動物白細胞計數，進行當天的第2次穴位照射或假照射。各組在假照射期間的第5d，測完第2次白細胞計數后，加測T、B淋巴細胞比值。

2.3 測外周血WBC計數方法 安靜環境中，室溫22℃，將兔固定于兔架上，耳廓背面剪去毛發以備采血，用手術燈照射耳部，使血管擴張便于取血。75%乙醇棉球耳緣靜脈區消毒后，用一次性靜脈輸液針耳緣靜脈放血，一次性微量吸管采血20μL，放入量杯搖勻后，滴入溶血素4滴再搖勻，用血球計數儀測WBC計數。預處理組WBC計數檢測為:1)實驗開始前，檢測動物正常WBC計數，測后造模;2)造模期間(共5d)的第3、5d注射環磷酰胺之前再測;3)造模后期(即造模后，共5天)，每天假照射前后采血檢測(包括當天首次治療前和3h后再次治療前)。對照組WBC計數測定時間為:1)實驗開始前，檢測動物正常WBC計數，測后造模;2)造模期的第3、5d注射環磷酰胺之前測定;3)造模后期，每天假照射前后采血檢測(包括當天首次治療前和3h后再次治療前)。

2.4 測外周T和B淋巴細胞方法 測完第2次WBC計數后，測 T、B淋巴細胞比值。安靜環境中，室溫22℃，75%乙醇棉球耳緣靜脈區消毒后，從耳緣靜脈用一次性注射器抽取0.8mL血置于含有抗凝劑的離心管中，用流式細胞儀測T、B淋巴細胞。

表1 預處理組與對照組在不同時間點的WBC計數比較(ˉx±s，G/L)

表2 同組家兔不同時間點的WBC比較(ˉx±s，G/L)

圖1 預處理組與對照組間WBC計數的比較

圖2 2組之間CD3+T淋巴細胞與CD19+B淋巴細胞構成比較

2.5 統計學方法 使用SPSS17.0統計軟件包，若數據服從正態分布，則采用ˉx±s表示;若數據不服從正態分布，則采用中位數、最小值、最大值(M，min，max)表示。統計推斷:1)WBC計數結果采用重復測量(Repeated Measures)數據資料的方差分析;2)T、B淋巴細胞的結果采用單因素方差分析(One-way Anova)，組間多重比較用LSD(方差齊時)或Dunnett T3(方差不齊時)。

3 結果

3.1 排除標準 建立WBC低下模型過程中，動物因為WBC低下，模型動物免疫功能衰弱易生病，感冒，泄瀉。故預處理組中，2只動物因拒食和感冒均被排除實驗。對照組中3只動物也因感冒，泄瀉和不明原因死亡均被排除實驗。

3.2 穴位照射預處理對WBC計數的影響 采用重復測量數據資料的方差分析，統計結果顯示，預處理組WBC計數與對照組有統計學差異(F=11.786，P＜0.001)，各時間點之間差異有統計學意義(F=181.977，P＜0.001)，進一步多重比較結果見圖1和表1。由圖1和表1可知，預處理組與對照組第1～5天在不同時間點上的WBC計數比差異有統計學意義(P＜0.01)。

3.3 穴位照射預處理對不同時間點的外周血WBC計數的影響 同組不同時間點的WBC計數比較見表2。由表2可看出，2組造模后5d時間內的WBC計數與造模前WBC計數相比有顯著差異(P＜0.01)，其對照組在5d時間內未恢復正常WBC水平范圍(7×109～13×109/L)，提示造模成功。預處理組1～5d WBC計數與造模后首測相比，WBC計數連續的增多，保持極顯著性差異(P＜0.01)，說明有減少免疫損傷的作用，顯示免疫系統功能從造模后開始而連續5d繼續向康復水平改善的過程。預處理組在3d假照射前WBC計數就已恢復到正常范圍(7×109～13×109/L)。對照組與造模后首測自相對比，1d、2d WBC計數無統計學意義，在第3d才有統計學意義(P＜0.05)，提示動物受到環磷酰胺的毒害損傷，使免疫功能恢復相對緩慢，而未恢復到正常WBC水平范圍(7×109～13×109/L)。說明，穴位照射預處理有減少免疫損傷，縮短康復時間的功效。

3.4 穴位照射預處理對外周T、B淋巴細胞百分比含量比較的影響 由表3、圖2可知，造模后5d，預處理組與對照組相比CD3+T細胞顯著增多，差異具有極顯著性(P＜0.01);CD19+B細胞顯著降低，差異有顯著性意義(P＜0.05)。預處理組與對照組相比T/B細胞的比值向正常范圍回升。

表3 外周血CD3+T、CD19+B淋巴細胞百分比含量(xˉ±s)

4 討論

本實驗采用環磷酰胺減低WBC指標作為免疫功能低下動物模型。環磷酰胺造模方法簡單易行，用量及時間可靈活掌握，故是常用的經典性制造免疫功能低下實驗模型的方法。本研究觀察外周WBC計數在穴位預處理照射中的免疫作用，發現預處理組照射足三里穴在造模后階段有使WBC計數增多的顯著作用，并縮短了康復時間，WBC數目在第3天已恢復到正常范圍(7×109～13×109/L)。同時，對照組WBC計數也天然增多，但并未恢復到正常范圍之內，也未恢復到該組造模前的WBC計數水平。預處理組與對照組相比，T細胞顯著增多(P＜0.01)，B細胞顯著降低(P＜0.05)，T/B細胞的比值回升。在造模后第5d，預處理組的T/B細胞的比值已回升到正常范圍，表明預處理“足三里”能刺激T細胞的生長、B細胞的減少、調節T/B細胞的比值。

足三里穴是胃之合穴，有益脾胃、助運化、理氣和血、祛邪防病的功效。中醫理論認為，脾胃為后天之本，氣血化生之源，陽明又為多氣多血之經，所以刺激胃經合穴足三里可調氣補血，是治療疾病的關鍵穴位。現代研究反復證明，足三里穴有促進和調節免疫功能的作用［2-6］。所以本實驗采用能雙補氣血的“足三里”穴，也是根據對該穴的相對特異性、以及現代免疫機制而決定的。

近年針灸界提出了“針灸預處理”一詞，所謂針灸預處理，是預先對機體的某些穴位進行刺激，以提高機體的抗病與應變能力，使未來可能產生的疾病對機體組織器官和功能的損傷有減輕的作用。針灸從本質上講，是一種物理刺激方法［7］，采用不同方法來刺激穴位都可達到激發經絡之氣，協調陰陽、調節機體功能的目的。預處理組的減少免疫損傷和縮短康復時間的療效，表明足三里穴在激光預處理時，對“神經-內分泌-免疫網絡”功能的調節作用，具有一定時間的延續性。從而推斷，調節“神經-內分泌-免疫網絡”功能的預處理，是針灸預防治療所強調的“治未病”的治療手段和治療方案。有鑒于激光照射足三里有提高WBC計數的作用，故能對WBC低下而引起的許多癥狀有重要的良性調節作用，有利于疾病的痊愈，故穴位預處理有其“治未病”的作用。

當今世界醫學的發展趨勢提倡和發展預防醫學。而中醫針灸醫學本質上是實用的臨床預防醫學，但到目前為止，在國際上并未得到足夠的重視和廣泛的應用。本實驗只是對足三里穴激光預處理治療的初步探討，采用穴位預處理來調節機體“神經-內分泌-免疫網絡”的治療方法，應該是中醫“治未病”的預防醫學的重要組成部分，今后有必要進一步對針灸預處理作更深入廣泛的臨床研究，加以提倡。

［1］郭義.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2008，403.

［2］Sun PL，Zhou YB，Mao HJ，Wu HH，Bu LL，Sun J，Guo HY.Relationship between electroacupuncture and spleen function on leukocyte.Journal of Acupuncture and Tuina Science，2007，5(6):336-340.

［3］Trinchieri G.Biology of natural killer cells.Adv Immunol，1989，47:187-376.

［4］駱永珍.針灸與免疫［M］.北京:人民衛生出版社，2002:239.

［5］Xie L，Zhao L，Li M.Zusanli Point Injection for Treating Leukopenia Induced by Radio-Chemotherapy.Journal of Traditional Chinese Medicine，2003，23(1):59-61.

［6］Liu P，Liu Y，Tang Q.Acupoint injection plus moxibustion on postchemotherapy leucopenia.Journal of Acupuncture and Tuina Science，2006，4(2):87-89.

［7］趙立巖.經絡學說在中藥透皮治療中的作用.中國針灸，1998，6:336.