中國北方漢族男性血管內皮生長因子受體2基因+4422（AC）n多態性與HiHiLo訓練敏感性的關聯研究

聶晶 胡揚 王景玲 衣龍燕 烏云格日勒

1 江西師范大學（南昌 330022）

2 北京體育大學

3 山東省射擊射箭訓練基地

4 內蒙古師范大學

血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）是由美國學者Bruce等在1992年從人臍靜脈內皮細胞cDNA文庫中應用與已知受體酪氨酸激酶（RTK）同源引物通過PCR擴增而獲得[1]。它與VEGF結合后，通過引起自身胞內激酶區特定酪氨酸自身磷酸化而活化，進而激活一系列下游信號分子，從而啟動核內VEGF基因的表達，完成VEGF促血管內皮細胞增殖、誘導新生血管形成等作用。已有研究發現，有氧耐力運動均能上調VEGFR2 mRNA水平，且VEGFR2蛋白表達增加與耐力運動導致肌組織毛細血管增生高度相關[2-8]。還有文獻報道，VEGFR2 mRNA表達的顯著上調僅出現在耐力訓練敏感組（即VO2max明顯提高）[9]。這些結果提示VEGFR2基因在有氧耐力運動中扮演了重要的角色，且mRNA表達的差異可能與基因多態性有關。

+4422（AC）n多態性位于人類VEGFR2基因第2內含子上，其功能意義尚不清楚。但有學者發現，該位點與某些病理表型有關聯，而且攜（AC）11等位基因者VEGFR2啟動子活性明顯強于攜（AC）12等位基因者，提示該多態可能是一個功能位點，會影響基因表達[10]。而能否利用該重復多態性來預測低氧訓練效果，目前尚未見此方面的報道。本研究通過30天高住高練低訓（HiHiLo），探討VEGFR2基因+4422（AC）n多態性與低氧訓練敏感性的關聯，以期為解釋低氧訓練效果的個體差異以及制定個性化的低氧訓練方案提供科學依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究選取71名中國北方漢族平原地區健康男性受試者，無低氧環境居住史，大多數來自北京體育大學體育系和運動系的中長跑、足球等耐力性項目專業，年齡21.10±1.37歲，身高177.93±5.26厘米，體重69.80±7.80公斤，運動年限4.29±2.12年。

1.2 實驗方法

1.2.1 低氧訓練方案

HiHiLo方案：低氧睡眠+低氧訓練+常氧專項訓練，共30天。其中低氧睡眠7 d/周，每晚至少10 h（晚21:00～次日晨7:00），氧濃度為14.8%～14.3%（模擬海拔2800～3000 m）；低氧訓練3次/周，低氧訓練方式為常壓低氧環境（氧濃度為15.4%～14.8%，模擬海拔2500～2800 m）蹬功率自行車30 min（60 r/min），以個體75%VO2max強度為基礎，運動過程中調節功率車負荷，使受試者SpO2維持在87%～93%。其余時間在常氧環境下進行專項訓練。

1.2.2 VO2max的測定

分別在HiHiLo前后測試1次。實驗方法為遞增負荷運動實驗，受試者以90W為起始負荷，以60轉/分的頻率蹬功率自行車，每2 min遞增30W。VO2max的判定標準為HR超過180次/分，呼吸商超過1.1，耗氧量不再增加，不能繼續堅持運動。測試儀器為德國Cortex-MetalyzerⅡ型心肺功能測試系統。

1.2.3 脈搏血氧飽和度（SpO2）的測定

分別在HiHiLo前后VO2max測試結束后的第2天測定。測定采用的運動方式為低氧環境下（15.4%O2，海拔約2500米）蹬功率自行車，運動強度為HiHiLo前個體75%VO2max，轉速為60轉/分。測試時，先讓受試者坐功率車上安靜，待HR、SpO2穩定后，開始采集安靜5分鐘每分鐘的SpO2值；然后以遞增負荷方式熱身5分鐘后間歇，等HR恢復至90～100次/分時，開始按規定負荷蹬功率車15分鐘，停止后恢復5分鐘（前2分半鐘反方向蹬，后2分半鐘轉為安靜）。記錄運動15分鐘和恢復5分鐘期間每分鐘的SpO2。測試儀器為美國產脈搏血氧飽和度測試儀（NONIN 8500）。

1.2.4 基因多態性分析

用Promega試劑盒提取全血DNA。采用PCR結合熒光標記復合STR-genescan方法檢測（AC）n多態重復次數。+4422（AC）n多態性在NCBI的SNPs庫中，編號為rs3034659。參考NC_000004.10序列，應用primer5.0自行設計引物，使用熒光標記FAM標記上游5’端。上引物：5’-FAM aag gct aat aca act ctt ca -3’（20bp）；下引物：5’-cag gtg gct gta ctg gtt-3’（18bp）。PCR 反應體系（15 μl） ：DNA 模 板 0.5 μl，Taq 酶（0.15 μl，5 U/μl），dNTP（0.3 μl， 10 mM），Mg2+（0.9 μl，25 mM），上下引物各 1.5 μl（0.05 μg/μl），buffer 1.5 μl，滅菌雙蒸水補齊。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；變性94 ℃40 s，退火56 ℃40 s，延伸72℃40 s，共35個循環；72 ℃延伸15 min。PCR反應產物使用ABI-377DNA分析儀確定片段長度，用genescan3.7軟件分析擴增產物，并對純合子進行測序鑒定其重復次數。

1.3 統計學分析

采用△（訓練后－訓練前）表示訓練敏感性。所有數據處理采用SPSS13.0軟件統計包完成。采用卡方檢驗和精確率檢驗受試者基因型頻率是否符合H-W平衡定律，以確認研究樣本的群體代表性；用K-S檢驗訓練前后生理指標數據是否符合正態分布；所有受試者低氧訓練前后指標的變化采用配對t檢驗；基因型之間各生理指標的初始值采用獨立樣本t檢驗，訓練敏感性采用協方差處理。顯著性水平設為P < 0.05，非常顯著性水平設為P < 0.01。

2 結果

2.1 VEGFR2基因+4422（AC）n多態性基因型和等位基因分布頻率

經genescan3.7軟件分析后，VEGFR2基因+4422（AC）n多態性出現四種基因型，分別為（AC）11/（AC）11型43人，頻率為60.56%；（AC）11/（AC）12型21人，頻率為29.58%；（AC）12/ （AC）12型5人，頻率為7.04%；（AC）11/（AC）13型2人，頻率為2.82%。（AC）11等位基因頻率為76.76%，（AC）12等位基因頻率21.83%，（AC）13等位基因頻率1.41%。經卡方檢驗，結果顯示：χ2（df=3）= 1.27，P = 0.74，表明該人群符合H-W平衡定律，具有群體代表性。

2.2 HiHiLo前后VO2max及定量負荷運動SpO2的變化

經過30天HiHiLo ，68名受試者（3人由于測試有誤，數據被刪去）VO2max和rVO2max較訓練前顯著性提高，分別增加了5.72±11.24%和6.81±11.22%；71名受試者定量負荷運動中和恢復期SpO2也較訓練前顯著性升高，分別提高了1.45±1.87%和1.20±1.48%，安靜狀態下SpO2未出現顯著性變化（表1，圖1）。

表1 HiHiLo后VO2max及定量負荷下SpO2的變化

圖1 HiHiLo后定量負荷下SpO2的變化

2.3 HiHiLo后各基因型VO2 max的變化

由于（AC）12/（AC）12和（AC）11/（AC）13兩種基因型人數均≤5，以下各指標只對（AC）11/（AC）11和（AC）11/（AC）12進行比較。表2顯示，HiHiLo前，各基因型的VO2max和rVO2max無顯著性差異；經過30天HiHiLo ，（AC）11/（AC）11基因型rVO2max的訓練敏感性顯著高于（AC）11/（AC）12基因型（P < 0.05）；且（AC）11/（AC）11基因型VO2max的訓練敏感性也有高于（AC）11/（AC）12基因型的趨勢（P < 0.1）。

2.4 HiHiLo后各基因型定量負荷下SpO2的變化

表3顯示，不同基因型者在定量負荷運動下SpO2初始值無顯著差異；HiHiLo后，各基因型定量負荷運動下SpO2訓練敏感性也未見顯著差異。

表2 HiHiLo后各基因型VO2max的變化

表3 HiHiLo后各基因型定量負荷下SpO2變化

3 討論

3.1 HiHiLo后運動能力的變化

本研究結果顯示，30天HiHiLo后，受試者VO2max的絕對值和相對值均較訓練前顯著提高 （P < 0.01），分別增加了5.72±11.24%和6.81±11.22%，表明該訓練方法明顯提高了機體有氧運動能力，這與Stray-Gundersen等學者的報道相一致[11]。但也有學者研究發現，4周HiHiLo后，運動員VO2max的提高并無統計學意義[12]。造成以上結果不同的原因可能與受試者個體差異、運動項目之間的差異、低氧環境以及訓練方法的差異有關。

目前，對SpO2的監測已被廣泛應用于運動訓練領域中，它在一定程度上可以反映機體缺氧的狀況。本研究發現，HiHiLo后，受試者在進行相同負荷運動中及運動后恢復期SpO2均較訓練前顯著升高（P < 0.01），表明機體缺氧狀況明顯改善，運動能力有所提高。造成此結果的原因可能主要還是與低氧刺激有關。有文獻報道，間歇性低氧暴露后，在低氧安靜時以及低氧運動時SpO2較暴露前顯著增加[13，14]。

3.2 VEGFR2基因+4422（AC）n多態性與VO2 max、SpO2 的關聯

在低氧環境中，肌組織通過毛細血管新生，縮短血管與組織細胞之間的氧氣彌散距離，擴大彌散面積，增加對細胞的供氧量，這是機體在組織水平上對低氧習服適應的重要機制。而VEGFR2在血管新生中發揮了重要作用[15，16]。有文獻報道，VEGFR2基因敲除的小鼠由于缺乏血管生成的能力而死亡[17]。因此，推測VEGFR2基因可能與低氧適應能力有關。而這種適應能力的好壞直接關系著訓練的效果。迄今為止，人類基因組中已發現了一些與低氧適應能力有關的基因多態性，但對微衛星多態性的報道不多。該多態性又被稱為短串聯重復（STR），它們分布廣泛，且其重復次數在個體間呈高度變異性，因而，也是目前在遺傳分析中應用最廣泛的遺傳標記之一。

本研究首次報道了VEGFR2基因+4422（AC）n多態性與HiHiLo訓練敏感性的關聯。結果顯示，HiHiLo后，（AC）11/（AC）11基因型rVO2max訓練敏感性顯著高于（AC）11/（AC）12基因型，且（AC）11/（AC）11基因型VO2max訓練敏感性也有高于（AC）11/（AC）12基因型的趨勢；在完成同等負荷的低氧運動中，SpO2敏感性在不同基因型之間未出現顯著差異。這表明VEGFR2基因+4422（AC）n多態性與HiHiLo后rVO2max的變化有關聯，而與定量負荷運動下SpO2的變化無關聯。其中（AC）11/（AC）11基因型者對HiHiLo訓練更敏感，提示該多態性可以用于預測低氧訓練效果。分析其關聯原因可能是由于該多態位于內含子上，而內含子在基因剪切過程中發揮著重要的作用。尤其是靠近外顯子的內含子區可能對于異源核RNA（hnRNA）→mRNA成熟過程中的選擇性拼接有重要影響。它通過參與5’端加帽、3’端加PolyA的形成，從而提高mRNA的穩定性，提高基因表達的效率；而且在內含子中還可能含有某些轉錄因子的結合位點，從而調控基因表達。另外，在特定情況下，內含子也可以作為增強子或沉默子影響到基因的轉錄表達[18]。因此，（AC）11/（AC）11基因型者可能表現出較高的VEGFR2 mRNA表達，從而增強了與VEGF的結合活性，產生促血管生成的生物學效應，有利于提高組織攝氧能力，導致機體VO2max增加。已有文獻報道，經過6周耐力訓練后，VEGFR2 mRNA僅在VO2max明顯升高組顯著上調[9]。這可能也進一步提示了VEGFR2基因表達的差異會影響有氧能力表型（VO2max），而基因多態性可以解釋這種個體差異。另一方面，該多態本身可能并不是功能位點，但與某個功能位點連鎖不平衡。近年來有文獻報道，VEGFR2基因的某些其他功能位點與臨床病理表型有關聯，可能是影響了 R2 與 VEGF 結合的有效性[19，20]。關于VEGFR2基因+4422（AC）n多態性與定量負荷低氧運動下SpO2變化無關聯，可能是該多態并不決定此表型。但我國學者鄭瀾等發現，血清VEGF含量與動脈血氧分壓顯著相關[21]。推測可能與VEGF受體活性有關。隨著低氧程度的增加，動脈血氧分壓下降，VEGF受體活性增強，與血清VEGF結合后，產生促血管生成效應，而使血中VEGF含量下降，這將有利于機體缺氧狀況的改善。因此，從理論上分析VEGFR2可能與低氧訓練后SpO2變化有一定聯系。但究竟本研究所選取的+4422（AC）n多態是不是功能位點，還需要進一步進行功能研究。而且，本研究中（AC）12/ （AC）12和（AC）11/（AC）13兩種基因型分布頻率偏低，因而有待于加大樣本量進行驗證。

另外，本研究也首次報道了VEGFR2基因+4422（AC）n多態性基因型及等位基因在中國北方漢族人群中的分布頻率。本結果與Kariyazono等報道該基因多態性在144名日本人中的分布頻率并不完全一致[10]。這可能與種族、地區的異質性以及樣本量的大小有關，也有待于其它研究的進一步驗證。

4 總結

VEGFR2基因+4422（AC）n多態性與HiHiLo后rVO2max訓練敏感性有關聯，而與定量負荷低氧運動下SpO2訓練敏感性無關聯。其中（AC）11/（AC）11基因型者對HiHiLo更敏感，提示VEGFR2基因+4422（AC）n多態性可以作為預測低氧訓練效果的分子遺傳學標記，但還有待于加大樣本量進行驗證。

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