TGF-β 對T細胞發育分化的影響與運動性免疫抑制

張琳 郝選明

1 華南師范大學生命科學學院（廣州 510631）

2 華南師范大學體育科學學院

運動員長期從事大強度的運動訓練，會發生強烈的運動性免疫抑制現象，表現在運動員免疫功能顯著降低，細胞免疫和體液免疫之間的平衡產生明顯的漂移或極化，不僅直接影響運動員的運動能力和比賽成績，而且會影響其運動壽命和身體健康。運動訓練影響機體的免疫功能表現在免疫細胞（尤其淋巴細胞）數量、活性及功能的變化。從機理上講，應該是長期的運動訓練從某個或數個環節，通過特定生物信息系統影響到淋巴細胞的發育、增殖、分化和成熟。轉化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是一種高度多效、功能復雜的生長與分化因子，它廣泛地調節機體的生長、發育、修復、免疫和炎癥等許多生理病理過程，對T細胞的發育具有很強的抑制作用，主要抑制其增殖和分化[1]。本文試圖闡述TGF-β家族結構特征及其影響T細胞發育分化的重要作用，并從TGF-β信號控制T細胞發育分化的角度探討運動免疫抑制的可能機理。

1 TGF-β及其受體的結構

已發現TGF-β有5種亞型，分別是TGF-β1～5。其中，哺乳動物主要表達TGF-β1～3，分別定位于 19， 1， 14 號染色體上[2]，由兩個相同或相似的亞基組成，借助二硫鍵相連接，分子量為12.5kD。TGF-β 受 體 (TGF-β receptor，TβR)是 具有跨膜域的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，已發現8種，目前研究比較清楚的為受體I、受體II和受體III，分子量分別為 55 kD、75 kD、280 kD[3]。信號傳導時，TGF-β與TβRII結合后，TβRII自身發生二聚化，然后與TβRI形成異源四聚體，TβRII磷酸化 TβRI的 GS區，活化的 TβRI結合信號分子，通過Smad或者Factor associated suicide/Factor associated suicide ligand（Fas/FasL），B cell lymphoma/lewkmia-2（Bcl-2）等信號通路調控細胞的增殖和凋亡[4]。

2 TGF-β對早期T細胞發育的影響

關于TGF-β作為早期T細胞內源性調節因子的最有力的證據來自體內基因功能的實驗[5]，該實驗通過TGF-β基因信號刪除、干細胞同源重組，或者通過種系特異性基因的靶向作用等技術進行了研究，實驗中TGF-β的配體或受體信號受到干擾而失活，但最終的結果都能使T細胞激活，T細胞自發地產生效應細胞因子和組織浸潤損傷；而且不論在定向的造血干細胞還是在T細胞中，上述效應都可發生。實驗結果表明TGF-β可抑制早期T細胞的發育而使T細胞系失調。

有研究表明，TGF-β影響早期T細胞發育，與一些細胞因子影響細胞分化的效果有關。體外實驗發現[6]TGF-β通過抑制白介素 2 （interleukin2,IL-2）和IL-7活性而抑制T細胞的發育。在對胎兒胸腺器官培養時加入TGF-β可導致T細胞分化受阻，表現為抑制了CD44+CD25-T細胞的發育和分化進程，減少CD44+CD25+和 CD44-CD25-等早期T細胞的表達。正常情況下，三陰性(TN)T細胞增殖時表達CD2，但CD3、CD4、CD8呈陰性，而加入TGF-β中和抗體抑制TGF-β活性后，這一狀況被逆轉[7]。胸腺上皮細胞表達TGF-β，可有效地阻止CD4--CD8loT細胞的增殖[8]。另外，在胸腺基質細胞中添加TGF-β的中和抗體，導致T細胞進入DNA合成期和合成后期/分裂期（S和G2/M）的細胞增加，表明TGF-β可影響T細胞的發育周期[9]。這些結果支持了TGF-β通過下調T細胞的增殖能力，抑制早期T細胞增殖。

3 TGF-β信號與T細胞增殖分化

成熟的T淋巴細胞進一步分化為輔助性T淋巴細胞（T helper lymphocyte， Th，CD4+/CD3+）和細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T cell，Tc，CD8+/CD3+）。Th細胞可分化為Th1和Th2細胞。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2，Th2細胞主要分泌IL-4和IL-10。Th1和Th2細胞通過所分泌細胞因子進行交互調節。T細胞的增殖、活化依賴這些細胞因子及其受體（如 IL-2[10]、IL-6[11]和 IL-7[12]等對淋巴細胞的增殖和活化發揮重要作用），因而影響這些細胞因子受體表達水平或受體反應，可能是TGF-β抑制T細胞增殖的機制。

研究表明，TGF-β能抑制T細胞分化為Th和Tc細胞、誘導T細胞的凋亡[13]、抑制Th細胞分化為Th1細胞和Th2細胞[14]。TGF-β能直接通過抑制轉錄因子T-box expressed in T cells (T-bet)[15]和下游的IL-12應答[16]，抑制IL-12依賴的Th1分化。TGF-β通過T細胞下游的信號阻斷Th1和Th2細胞分泌細胞因子，包括阻止磷酸化激酶、細胞內鈣和MAPK級聯的活化[17]。在體模型大多支持TGF-β抑制Th1應答的進程，TGF-β1及其受體缺失的小鼠IFN-γ和其它致炎細胞因子的產出量顯著上升，特別是在造血干細胞池，T細胞表達顯性負相的TβRII，導致Th1和Th2細胞因子的生成增加[18]。此外，TGF-β1 還可通過抑制 T-bet和 GATA binding protein3（GATA-3）表達，阻斷Th1和Th2細胞的分化[19]。

4 TGF-β和調節性T細胞（regulatory T cells，Treg細胞）

目前，Treg細胞是免疫學領域研究的熱點。Treg細胞具有誘導機體免疫應答低下和免疫抑制的功能，通過“主動”的方式抑制免疫系統對自身和外來抗原的應答，在維持機體免疫耐受和免疫應答穩態方面具有非常重要的作用。現已證實，除了CD4+Treg細胞外，一部分CD8+T細胞、CD4-CD8-T細胞、NKT細胞也具有免疫調節功能。CD4+Treg細胞根據其來源和抑制機制，可以分為天然產生 CD4+CD25+Treg細胞和誘導產生Treg細胞(如Th3、Trl細胞)。天然產生的Treg細胞抑制機制可能主要通過“感染免疫耐受”，是細胞接觸依賴性及細胞因子非依賴性；而誘導產生的Treg細胞則主要為細胞接觸非依賴性及細胞因子依賴性[20]。目前普遍認為CD4+CD25+Treg細胞起源于胸腺，主要證據是，小鼠出生3d內切除胸腺，成熟后外周無CD4+CD25+Treg細胞并患自身免疫性疾病。有研究推測是胸腺中CD4+T細胞受到中等強度的抗原刺激，活化后表達CD25分子并獲得抑制性調節活性[21]。

TGF-β作為T細胞增殖、分化的抑制因子[22]，對這些調節性T細胞的發育[23]、亞型維持[24]和最終的效應功能[25]等起調節作用。Schramm等[26]發現高表達TGF-β轉基因小鼠的外周和胸腺中CD4+CD25+T細胞數量明顯增加；如果同時阻斷其TGF-β信號則下降至正常值；相反，在單純TGF-β信號缺陷轉基因小鼠中，CD4+CD25+T細胞在外周淋巴組織中數量減少而胸腺無明顯變化，這表明TGF-β對CD4+CD25+調節性T細胞的調控可能主要在外周而非胸腺。

如上所述，天然產生CD4+CD25+Treg細胞的抑制功能是細胞因子非依賴性的，但是當這種誘導產生的具有抑制功能的CD4+CD25+T細胞再去訓導外周的初始 CD4+CD25-T細胞轉化為具有抑制功能的CD4+CD25+T細胞，這種第二代CD4+CD25+T細胞的抑制功能依賴于IL-10和TGF-β，而所有上述的這些具有抑制功能的T細胞都表達forkhead box P3 （Foxp3）[27]。這些結果表明上述作用可能與Foxp3的表達有關。Foxp3是調節性T細胞發育過程中必需的特異性轉錄因子，特異地表達于Treg細胞，在Treg細胞的發育過程中發揮重要作用。TGF-β在體內能調節Foxp3并增加其表達，進一步表明TGF-β對維持CD4+CD25+T細胞的平衡十分重要。Fantini等人[28]通過TGF-β刺激初始CD4+T細胞后，發現smad7 mRNA表達上調，而在Foxp3+T細胞中，smad7 mRNA的升高則被抑制。由此說明TGF-β介導Foxp3表達可能與smad 7有關。

5 TGF-β與運動免疫抑制的可能機制探析

鑒于上述TGF-β在T細胞增殖、分化、成熟及其功能調節中的重要作用，在運動性免疫抑制的發生發展過程中，TGF-β將發揮其作用。運動影響TGF-β與T細胞發育和免疫抑制功能之間關系的研究在運動醫學中尚未引起足夠的重視。現有的文獻多集中于TGF-β對機體免疫功能的影響，以及運動如何影響TGF-β表達水平及其與某些相關細胞因子相互作用的研究。

Elenkov等[29]認為，體內TGF-β水平變化與機體所處的環境有關：急性或慢性應激、長期應激停止后、劇烈運動時，以及懷孕和產后期，機體通過調節全身或局部的促/抗炎癥因子，可以抑制/激活TGF-β活性。在對急性運動或長期訓練的研究中發現，血清中 TGF-β1 水平上升[30]。Inoue 等[31]的研究表明，運動訓練后，TGF-β被激活，大腦中自發性神經元活性受到抑制，這可能是機體產生疲勞感的誘因。Gosselin等的[32]研究也表明，運動損傷引起的炎癥反應時，TGF-β水平上升。Serra等[33]認為，運動訓練可以阻止促炎因子如TNF和IL-6的上升，升高IL-10水平，減弱TGF-β1 mRNA的表達。而García等的[34]研究表明，一次性大強度運動可通過增加中性粒細胞的吞噬能力和氧依賴性殺傷能力，從而提高機體炎癥應答，但TGF-β沒有發生明顯變化。Hering等[35]對10名健康學生進行低強度訓練后，進行4周的高強度運動，發現運動后兩周TGF-β1濃度由基礎值525 pg/ml上升至710 pg/ml ，其后2周慢慢下降到650 pg/ml，4周后下降到440pg/ml，表明大強度運動可短暫地提高血漿中TGF-β1的濃度，并且認為血漿中TGF-β1的升高部分是由于骨髓中潛在的TGF-β1（包括TGF-β1的前體分子和結合蛋白）的釋放。

在對運動后血液中TGF-β1來源問題的研究中，Czarkowska-Paczek等[36]認為，運動后血清中TGF-β1水平的升高不是來源于心肌或骨骼肌。他們發現，6周訓練可引起骨骼肌TGF-β1 mRNA明顯升高，蛋白水平卻下降，6周訓練心肌中TGF-β1表達也沒有明顯變化；對未訓練及大強度訓練6周的大鼠進行一次性急性運動后發現，急性運動后即刻,未訓練鼠骨骼肌TGF-β1 mRNA沒有顯著性變化，而訓練組TGF-β1表達則下降。因此，運動訓練后骨骼肌和心肌TGF-β1水平并沒有升高。而Gavin等的[37]研究表明，5天的遞增負荷大強度運動就可以明顯提高骨骼肌內TGF-β基因表達水平。這提示：身體運動對骨骼肌TGF-β1基因表達可能是一個潛在的刺激因素，其蛋白水平并不一定會升高。運動中組織器官TGF-β1的表達是否存在一個閾值，它可能與運動強度、運動時間有關，具體機制尚需進一步的實驗支持。

鑒于此，有必要對TGF-β與運動性免疫抑制關系進行深入研究。筆者認為應重視下述問題。

（1）T細胞發育的多個環節受到TGF-β調控，一旦T細胞亞群平衡遭受破壞(如CD4+/CD8+比例下降，Th1/Th2漂移等)， 就會引起免疫功能抑制。運動對TGF-β表達水平有什么影響，以及不同運動類型對TGF-β表達有何不同作用？運動對TGF-β影響又是通過哪些途徑及機制來實現的? TGF-β表達水平的變化對T細胞發育有何影響？

（2）機體免疫功能是由神經、內分泌、免疫網絡共同調節的，T細胞作為重要的免疫細胞，對維持機體細胞免疫功能具有重要作用。有研究表明，運動后大腦中的TGF-β可通過腹內側和丘腦下核旁室的去甲腎上腺素能神經元提高脂肪的氧化能力[38]。那么，在運動訓練條件下，TGF-β是否可通過下丘腦等神經通路或內分泌途徑調節T細胞的發育過程，從而影響機體的免疫功能？

（3）運動訓練過程中TGF-β濃度及活性在各組織或器官中的變化情況及其機制尚未明確。運動過程中TGF-β如何在這些組織或器官之間發揮獨立和/或相互作用？通過哪些信號途徑？這些信號途徑對T細胞發育和功能有何影響？在運動性免疫抑制發生發展中在多大程度上發揮作用？

（4）研究表明[39]，TGF-β對于成纖維細胞和平滑肌細胞的作用與其濃度有關，低濃度時刺激其生長；高濃度時則起抑制作用。那么，在不同的身體運動過程中，TGF-β的濃度有什么變化？這些變化是否與運動強度、運動時間以及運動類型有關？而且TGF-β濃度的變化是否會影響到T細胞的分化與發育，進而影響運動性免疫抑制的發生與發展？

（5）由于TGF-β家族包含有5種亞型和8種受體，每種亞型及其受體的作用與結構類型也有差異。所以對一種亞型的研究并不能成為所有亞型的生物學作用及其對運動免疫機制的直接或間接證據。對于在運動應激引起的運動性損傷與修復機制中，TGF-β各亞型及其受體起何作用，哪種因子起著更重要的作用，其信號轉導途徑如何等，仍然需要更多的實驗研究。

（6）TGF-β除了作為生長抑制性因子具有免疫抑制功能外，還可能作為抗炎因子，通過多種機制起到抗炎作用。通過補充TGF-β能否在運動訓練中有效抗炎止痛，保護機體免受更嚴重的損傷，促進運動創傷的康復與治療還有待證實。

總之，運動時TGF-β與T細胞發育分化時細胞亞群、細胞因子及其調控因素和免疫功能之間有著非常密切的關系，在運動性免疫抑制發生發展中可能起重要的調節作用。而這些問題的探討有助于在運動訓練過程中，選擇適度的運動，以利于免疫功能的提高，抑制免疫功能的應激激素和親炎性因子，穩定抗炎性細胞因子的水平，減少及抑制疾病的發生發展，并可為探討運動性免疫抑制的機理與運動訓練中運動性免疫抑制的調理提供新的思路和方法。

[1]Thomas DA, Massague J. TGF-beta directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance. Cancer Cell, 2005,8(5): 369-380.

[2]Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF. Role of transforming growth factor beta in human disease. N Engl J Med，2000, 342(18): 1350-1358.

[3]Yamada SD, Baldwin RL, Karlan BY. Ovarian carcinoma cell cultures are resistant to TGF-beta-mediated growth inhibition despite expression of functional receptors. Gynecol Oncol, 2002,75:72-77.

[4]Zhu S, Goldschmidt-Clermont PJ, Dong C. Transforming growth factor-beta-induced inhibition of myogenesis is mediated through Smad pathway and is modulated by microtubule dynamic stability. Circ Res, 2004, 94(5): 617-625.

[5]Kulkarni AB, Thyagarajan T, Letterio JJ. Function of cytokines within the TGF-beta superfamily as determined from transgenic and gene knockout studies in mice.Curr Mol Med，2002，2(3):303-27.

[6]Plum J, De Smedt M, Leclercq G, et al. Inf l uence of TGF-beta on murine thymocyte development in fetal thymus organ culture. J Immunol，1995，154(11):5789-5798.

[7]Mossalayi MD, Mentz F, Ouaaz F, et al. Early human thymocyte proliferation is regulated by an externally controlled autocrine transforming growth factor-beta 1 mechanism. Blood，1995，85(12):3594-3601.

[8]Takahama Y, Letterio JJ, Suzuki H, et al. Early progression of thymocytes along the CD4/CD8 developmental pathway is regulated by a subset of thymic epithelial cells expressing transforming growth factor beta. J Exp Med，1994，179(5):1495-1506.

[9]Mukamoto M, Kodama H. Regulation of early chicken thymocyte proliferation by transforming growth factorbeta from thymic stromal cells and thymocytes .Vet Immunol Immunopathol，2000，77(1-2):121-132.

[10]McKarns SC, Kaminski NE. TGF-beta 1 differentially regulates IL-2 expression and [3H]-thymidine incorporation in CD3 epsilon mAb- and CD28 mAb-activated splenocytes and thymocytes. Immunopharmacology，2000，48(2):101-15.

[11]Baroni T, Carinci P, Bellucci C, et al. Cross-talk between interleukin-6 and transforming growth factor-beta 3 regulates extracellular matrix production by human fibroblasts from subjects with non-syndromic cleft lip and palate. J Periodontol，2003，74(10):1447-1453.

[12]Tang J, Nuccie BL, Ritterman I, et al. TGF-beta downregulates stromal IL-7 secretion and inhibits proliferation of human B cell precursors. J Immunol，1997，159(1):117-125.

[13]Lin CM, Wang FH, Lee PK. Activated human CD4+T cells induced by dendritic cell stimulation are most sensitive to transforming growth factor-beta: implications for dendritic cell immunization against cancer. Clin Immunol，2002，102(1):96-105.

[14]Gorelik L, Constant S, Flavell RA. Mechanism of transforming growth factor beta-induced inhibition of T helper type 1 differentiation. J Exp Med，2002，195(11):1499-1505.

[15]Lin JT, Martin SL, Xia L, et al. TGF-beta 1 uses distinct mechanisms to inhibit IFN-gamma expression in CD4+T cells at priming and at recall: differential involvement of Stat4 and T-bet. J Immunol，2005，174(10):5950-8.

[16]Pardoux C, Ma X, Gobert S, et al. Downregulation of interleukin-12 (IL-12) responsiveness in human T cells by transforming growth factor-beta: relationship with IL-12 signaling. Blood，1999，93(5):1448-55.

[17]Chen CH, Seguin-Devaux C, Burke NA, et al. Transforming growth factor beta blocks Tec kinase phosphorylation,Ca2+inf l ux, and NFATc translocation causing inhibition of T cell differentiation. J Exp Med，2003，197(12):1689-99.

[18]Gorelik L, Flavell RA. Abrogation of TGF beta signaling in T cells leads to spontaneous T cell differentiation and autoimmune disease. Immunity，2000，12(2):171-81.

[19]McKarns SC, Schwartz RH. Distinct effects of TGF-beta 1 on CD4+and CD8+T cell survival, division, and IL-2 production: a role for T cell intrinsic Smad3. J Immunol,2005,174(4):2071-2083.

[20]Jonuleit H, Schmitt E. The regulatory T cell family ：distinct subsets and their interrelations. J Immunol, 2003,171 (12): 6323-6327

[21]Fehervari Z, Sakaguchi S. Development and function of CD25+CD4+regulatory T cells. Curr Opin Immunol,2004, 16(2):203-208.

[22]Li MO, Wan YY, Sanjabi S, et al. Transforming growth factor-β regulation of immune responses. Annu Rev Immunol, 2006, 24: 99-146.

[23]Wan YY, Flavell RA. Identifying Foxp3-expressing suppressor T cells with a bicistronic reporter. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(14):5126-5231.

[24]Marie JC, Letterio JJ, Gavin M, et al. TGF-beta1 maintains suppressor function and Foxp3 expression in CD4+CD25+regulatory T cells. J Exp Med，2005，201(7):1061-1067.

[25]Piccirillo CA, Letterio JJ, Thornton AM, et al. CD4+-CD25+regulatory T cells can mediate suppressor function in the absence of transforming growth factor beta1 production and responsiveness. J Exp Med，2002，196(2):237-46.

[26]Schramm C , Huber S, Protschka M, et al. TGF beta regulates the CD4+CD25+T-cell pool and the expression of Foxp3 in vivo. Int Immunol, 2004, 16: 1241-1249.

[27]Zheng SG, Wang JH, Gray JD, et al. Natural and induced CD4+CD25+cells educate CD4+CD25-cells to develop suppressive activity: the role of IL-2, TGF-beta, and IL-10. J Immunol，2004，172(9):5213-5221.

[28]Fantini MC,Becker C,Monteleone G, et al. Cutting edge:TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25-T cells through Foxp3 induction and down regulation of Smad7. J Immunol, 2004, 172(9): 5149-5153.

[29]Elenkov IJ, Chrousos GP. Stress hormones, proinf l ammatory and antiinf l ammatory cytokines, and autoimmunity.Ann N Y Acad Sci，2002，966:290-303. Review.

[30]Czarkowska-Paczek B, Bartlomiejczyk I, Przybylski J.The serum levels of growth factors: PDGF, TGF-beta and VEGF are increased after strenuous physical exercise. J Physiol Pharmacol，2006，57: 189-197.

[31]Inoue K, Yamazaki H, Manabe Y, et al. Transforming growth factor-beta activated during exercise in brain depresses spontaneous motor activity of animals. Relevance to central fatigue. Brain Res，1999，846(2):145-153.

[32]Gosselin LE, McCormick KM. Targeting the immune system to improve ventilatory function in muscular dystrophy. Med Sci Sports Exerc，2004，36(1):44-51.

[33]Serra AJ, Santos MH, Bocalini DS, et al. Exercise training inhibits inflammatory cytokines and more than prevents myocardial dysfunction in rats with sustained beta-adrenergic hyperactivity. J Physiol，2010，588(Pt 13):2431-2442. Epub 2010 May 4.

[34]García JJ, Bote E, Hinchado MD, et al. A single session of intense exercise improves the inf l ammatory response in healthy sedentary women. J Physiol Biochem，2010 Oct 9.[Epub ahead of print]

[35]Hering S, Jost C, Schulz H, et al. Circulating transforming growth factor beta1 (TGFbeta1) is elevated by extensive exercise. Eur J Appl Physiol，2002,86(5):406-410.

[36]Czarkowska-Paczek B, Zendzian-Piotrowska M, Bartlomiejczyk I et al. The effect of acute and prolonged endurance exercise on transforming growth factor-beta 1 generation in rat skeletal and heart muscle. J Physiol Pharmacol，2009，60(4):157-162.

[37]Gavin TP, Wagner PD. Effect of short-term exercise training on angiogenic growth factor gene responses in rats. J Appl Physiol，2001，90(4):1219-1226.

[38]Fujikawa T, Matsumura S, Yamada H, et al. Transforming growth factor-beta in the brain enhances fat oxidation via noradrenergic neurons in the ventromedial and paraventricular hypothalamic nucleus. Brain Res，2007，1173:92-101.

[39]Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF. Role of transforming growth factor β in human diseases. N Engl J Med，2000，342, 1350-1358.