馬藺不同生長階段嫩葉POD和EST同工酶分析

李強棟，孟 林，毛培春，張德罡，韓潤英

（1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.北京市農林科學院 北京草業與環境研究發展中心，北京 100097；3.內蒙古通遼市畜牧獸醫科學研究所，內蒙古 通遼 028000）

馬藺（Iris lactea）系鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物，廣泛分布我國華北、西北、東北、華東和青藏高原等地。生長在較低濕的鹽堿灘地以及高山河谷地區，可稱為優勢單純的群落，尤以過度放牧的鹽堿化草地上較多，而在重鹽漬化和地下水位較深的干燥環境較少。馬藺具有耐鹽堿、耐粗放管理、抗旱抗寒性強等特點，花色淡雅、葉色澤青綠柔軟厚實、病蟲害少、修剪頻率少，是優良的生態觀賞地被植物，在綠化、水土保持、植被恢復等方面具有開發潛力［1，2］。近年來，科學工作者對馬藺的研究集中在形態結構特征與地理分布關系、破除種子休眠、提高發芽率、抗旱抗寒性、耐鹽堿能力及其他抗逆性鑒定、引種及馴化和栽培、組織培養和繁殖推廣等方面［3］，而關于馬藺種質材料遺傳多樣性方面的工作報道較少［4，5］。

酶是基因表達的產物，酶蛋白多肽鏈結構中的氨基酸順序是由DNA上結構基因所攜帶的遺傳信息決定的，而同工酶分析是通過電泳技術把酶蛋白分子分離，然后通過組織化學特異性染色將其位置和活性直接在染色區帶以酶譜形式標記出來。因此，通過對酶譜分析就能識別控制這些譜帶所表達的基因，從而在生化水平上研究植物體遺傳變異［6，7］。1980年Brewbaker等對玉米（Zea mays）同工酶電泳發現，玉米中過氧化物酶同工酶存在不同組織及不同生長階段的多型現象［8］，之后關于植物不同組織器官、不同生長階段同工酶差異性已有較多報道，而且不同種類同工酶具有生長階段和組織特異性［9，10］。

以采自我國北方5省區11份野生馬藺為實驗種子，繁殖后分別于營養階段和生殖生長階段隨機選取其健康功能葉用于同工酶分析，通過分析營養生長階段及生殖生長階段的POD和EST（POD，E.C.1.11.1.7；EST，E.C.3.2.1.1）酶譜特征的變化，探討2種同工酶的多種分子形式在不同居群間的表型特征與遺傳結構之間的連續性、穩定性及變異性，酶蛋白的多種分子形式所具有生長階段特異性及不同組織器官特異性。以期在生化水平上，為利用同工酶技術分析馬藺種質材料遺傳多樣性提供理論數據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料來源

以采集的我國北方5省區不同生境分布的11份野生馬藺種子為實驗材料（表1）。

表1 實驗馬藺種質材料及其來源Table 1 Source of tested germplasms

1.2 實驗方法

1.2.1 日光溫室 將收集到的不同生境馬藺種子，于2009年在北京市農林科學院草業中心日光溫室種子繁殖，幼苗培育之后移栽大田管理。育苗時在內徑21 cm，高18cm的花盆裝入3kg培養基質（過篩土∶草炭＝2∶1），每份材料3次重復，每重復50粒種子［3］。大田生長及時除雜、澆水。

1.2.2 酶液提取 分別剪取不同生長階段馬藺幼嫩葉片1g，洗凈并剪碎放入預冷的研缽。先加入2mL預冷的緩沖液（POD 0.065mol/L Tris－檸檬酸 pH 8.2；EST 1mol/L Tris－HCl pH 8.3），在冰浴中研磨，沖洗于5mL離心管中，在10 000r/min 4℃冷凍離心機中離心5min，取上清液加入等體積10%甘油，分裝于0.3mL離心管中，保存于－20℃冰箱以備點樣［7］。

1.2.3 電泳及染色 參照文獻［11］電泳體系及凝膠染色方法，并做適當調整。POD用改良聯苯胺法染色，EST采用萘酯－偶氮色素法染色。染色后的膠版用7%冰醋酸漂洗固定脫色。重復多次，選取清晰、整齊的凝膠拍照并作進一步分析。

1.2.4 凝膠分析 凝膠譜帶的不同染色深度表示酶活性強弱，將酶活性劃分為4個等級，從4至1依次為強、較強、弱、最弱。根據各個譜帶的遷移距離計算其相對電泳遷移率（Rf＝凝膠中譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離），同時繪制凝膠酶譜模式圖［12］。

2 結果與分析

2.1 同工酶酶譜特征分析

通過酶電泳實驗，研究了11份馬藺種質材料在營養和生殖生長階段的POD和EST同工酶（圖1～4）。結果表明，供試材料POD和EST共顯示出了22個不同酶帶，即POD－A～POD－M 和EST－A～EST－I。依照經驗［13］，將酶帶劃分為快、慢兩區，其中 POD－A～POD－H 和 EST－A～EST－H 為慢區（SS），POD－H～POD－M 和 EST－I為快區（FF），其 Rf介于0.041～0.875（表2、3）。其中，POD－A、D、F、J和 EST－A、D、E、I為馬藺的基本譜帶，而POD－E、G和EST－B、G等4條譜帶僅出現在2、3和10號馬藺種質材料，其Rf分別為0.196、0.227、0.583，0.713，為材料所具有的特征譜帶?；咀V帶是不同居群間種質材料具有相同起源基因的證明，而4條特征酶帶表明了植物在不同的生態地理環境中發生了不同的趨異分化，這些譜帶可作為植物在不同生長階段，組織與器官系統發育的特異性指標，以及鑒定品種和物種分類的指標［14－16］。

2.2 不同生長階段EST同工酶分析

隨著植株從營養到生殖生長階段，EST總酶帶數由65條減少到61條，酶帶數變化不大（圖1b，2b）。其中，1號材料 EST－F，2號 EST－H，4號 EST－F，5號EST－F、－H酶帶在生長過程中發生缺失現象；5號材料出現EST－C酶帶。相比較營養生長階段，生殖生長階段的EST基本譜帶沒有發生缺失或增加現象，僅在酶活性方面有變化。如1，2和3號馬藺種質材料的EST－A酶帶由2級降為1級，4～9號材料的EST－A酶帶由3級降為2級，1～4號的EST－C酶帶較營養生長階段降了1級；2號的EST－C與6、7號的EST－D酶帶由2級變為3級。其中，特征譜帶3號EST－B和10號EST－G酶帶的酶活性降低。表明馬藺在不同生長階段EST存在變化，營養生長階段EST酶譜的酶活性較生殖生長階段更強，酶譜表現也更清晰（圖1a、2a）。

圖1 馬藺種質材料營養生長階段EST酶譜及模式圖Fig.1 The EST photograph and ideogram of Chinese Irisin vegetative growth stage

圖2 馬藺種質材料生殖生長階段EST酶譜及模式圖Fig.2 The EST photograph（a）and ideogram（b）of Chinese Irisin reproductive growth stage

表2 馬藺種質材料不同生長階段EST酶帶數及遷移率Table 2 Total EST bands and Rf value of Chinese Irisin vegetative and reproductive growth stages

2.3 不同生長階段POD同工酶分析

隨著植株從營養階段到生殖生長階段，POD總酶帶數仍為79條，酶帶數沒有發生變化，但在不同遷移率帶的缺失及酶活性方面發生變化（圖3b、4b）。其中，材 料2號 POD－B、－E、－G、－J、－K 酶 帶，5 號 POD－J酶帶，10號POD－A、－J酶帶在生長推進過程中發生缺失現象，而部分材料較營養生長階段有新酶帶出現，如2號的POD－B、－F酶帶，3號的POD－C酶帶，6號POD－B酶帶，8號 POD－A 酶帶，9號的 POD－J、－K 酶帶，10號POD－D、－L酶帶。酶活性變化也相當豐富，如1號材料 POD－F、－J、－K 酶 帶，2 號 POD－A、－L 酶 帶，4 號POD－F酶帶，5號 POD－B酶帶，8號 POD－B、－C、－D 等酶帶的酶活性隨著生長階段推進而降低；材料3號的POD－J、－K，4 號 POD－J，6 號 POD－H、－K，9 號 PODH、－I等酶帶的酶活性增強。說明POD酶活性同樣隨著植物生長階段的不同發生變化，在生殖生長階段POD酶譜的酶活性較營養生長階段更強，酶譜表現也較清晰（圖3a、4a）。

圖3 馬藺種質材料營養生長階段POD酶譜及模式圖Fig.3 The POD photograph（a）and ideogram （b）of Chinese Irisin vegetative growth stage

圖4 馬藺種質材料生殖生長階段POD酶譜及模式圖Fig.4 The POD photograph（a）and ideogram（b）of Chinese Irisin reproductive growth stage

3 討論與結論

3.1 馬藺同工酶技術應用

同工酶技術作為檢測物種遺傳多樣性的一種生化標記方法，隨著酶譜技術研究的迅速發展及讀譜技術的成熟，酶電泳信息數據的處理與分析對系統分子進化、發生和遺傳的研究越來越重要。丁毅等［17］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了產于我國不同地區的近緣野生大麥及栽培大麥，指出近緣野生大麥同栽培大麥之間具有相同的酶譜類型，在育種過程中選取不同類型酶譜或者酶譜相同而地理距離較遠的材料進行雜交配組。韓天文等［18］用同工酶技術對5個蘇丹草（Sorghum sudanense）品種酯酶同工酶進行分析，指出蘇丹草幼苗葉片相比較根部酯酶譜帶較少，同時利用Rf為0.84位點能夠快速有效地區分5個蘇丹草品種。張雪婷等［19］通過對隴東野生紫花苜蓿過氧化物酶同工酶譜的研究，發現其與多數苜蓿種質材料存在較大的遺傳差異，單獨聚為一類。

由此看出，同工酶技術應用于物種遺傳變異、植物細胞分化和個體發育、親緣關系鑒定和植物育種方面研究具有實際意義，可以作為重要的遺傳標志。此次實驗通過對馬藺2個生長發育階段同工酶譜變化分析，發現嫩葉同工酶在營養生長和生殖生長階段有相對穩定性，適合用于馬藺同工酶分析樣品提取。通過進一步酶譜統計，供試材料POD和EST共顯示出了22個不同酶帶，其中，有8條基本譜帶和4條特征譜帶，基本譜帶說明11份材料具有遺傳上的同源性，一方面可以作為馬藺不同發育階段酶譜的識別標志；另一方面，說明不同生態地理位置生長的馬藺具有親緣關系；而特征譜帶及不同位點的酶譜、酶活性等說明種間存在明顯的差異，表明它們的異染色質之間存在多態性。植物受到不同生境影響，遺傳分子水平發生變異，從而導致同工酶水平發生相應的變異，而通過酶譜能識別控制這些譜帶所表達的基因，客觀上說明了不同地理位置馬藺種質材料的遺傳關系，利用過氧化物酶和酯酶酶譜分析作為一項鑒定指標具有重要的應用價值，為馬藺遺傳多樣性鑒定和育種等工作提供依據［20］。

表3 馬藺種質材料營養生長階段POD酶帶數及遷移率Table 3 Total POD bands and Rf value of Chinese Irisin vegetative and reproductive growth stages

3.2 馬藺不同生長階段同工酶變化

在生物進化中，同工酶為了適應細胞代謝的多方面需求而產生，其在生理上表現為對代謝的調節作用［21］。當一個酶受多個基因控制時，更容易適應環境的變化，廣泛存在于植物體內的過氧化物酶同工酶是植物體適應環境變化并對變化做出靈敏反應的一類酶，常被認為是植物對環境抗逆性強弱的標志。梁慧敏等［22］通過測定變溫處理情況下苜蓿不同器官過氧化物酶同工酶變化，指出溫度降低，苜蓿過氧化物酶同工酶酶活性增加，而與溫度上升呈明顯的負相關。酯酶是催化酯類化合物水解的酶系，它催化羧酸酯類的酯鍵的水解或合成，在植物不同的生長發育時期表現出器官特異性和階段的特異性［6］。劉波等［23］通過酶電泳實驗指出，不同居群半夏（Pinellia temate）不同酶系統中均有半夏物種的共同特征譜帶，同時又蘊含著豐富的多態性。馬彥軍等［24］利用酶電泳技術研究不同濃度PEG處理尖葉胡枝子（Lespedeza hedysaroides）幼苗葉片同工酶及酶活性變化，說明同工酶與作物抗旱性有一定關系，在水分脅迫后，葉片酶譜遷移率大小不同，說明在不同逆境下出現了不同酶的基因表達。在植物的不同發育階段和不同器官組織中同工酶都具有特異性表現，其合成受到一系列基因的調控，常作為遺傳信息的指標來研究植物的生長發育和器官分化［25，26］。在對11份馬藺POD和EST分析時發現，不同生長階段的酶帶數和酶活性強弱差異較大，如營養生長階段EST酶譜的酶活性較生殖生長階段更強，酶譜表現也更清晰，而生殖生長階段POD酶譜的酶活性較營養生長階段更強，酶譜表現也較清晰。同丁玲等［10］采用過氧化物酶和酯酶分析了菊花營養生長和生殖生長階段不同器官的同工酶變化相似，指出菊花的2個酶系統POD和EST分別在營養生長階段和生殖生長階段清晰、分離好，具有多態性，隨著植物生長發育過程，植物組織或器官的生理特性和代謝過程發生深刻變化，同工酶也隨之變化。說明不同種類植物體同工酶表現出組織特異性和發育階段特異性，可以利用同工酶電泳酶譜信息數據為馬藺遺傳多樣性提供生化水平分析的理論依據。

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