慈溪市本地櫻桃葉蛋白SDS-PAGE分析

陳曉強，黃士文，喬君偉，王國良，徐雪權，謝國權

（1. 浙江省慈溪市橫河鎮(zhèn)農業(yè)技術服務中心，浙江 慈溪 315318；2. 浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 浙江 慈溪 315100）

慈溪市本地櫻桃葉蛋白SDS-PAGE分析

陳曉強1，黃士文1，喬君偉2，王國良2，徐雪權1，謝國權1

（1. 浙江省慈溪市橫河鎮(zhèn)農業(yè)技術服務中心，浙江 慈溪 315318；2. 浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 浙江 慈溪 315100）

采用SDS-PAGE電泳方法對12個櫻桃品系的葉蛋白進行電泳分析，并進行聚類分析，結果表明，每個樣品分別獲得多條蛋白質條帶，慈溪市不同櫻桃品種的葉蛋白的分子量有明顯差異；聚類結果顯示，12份不同櫻桃種類在0.50時聚為3類：子陵1號、黑珍珠、短柄2號、相公殿、子陵2號、短柄2號為一類，童岙2號、紅花櫻、五月櫻、諸暨短柄、下楊家為一類，童岙1號單獨為一類。

慈溪；櫻桃；蛋白質；SDS-PAGE

慈溪市櫻桃種質資源豐富，但櫻桃遺傳背景尚不了解，品種混亂。近年來隨著櫻桃需求的急劇增加，提高櫻桃的質量及產量可進一步增加慈溪櫻桃果農的收入，為此，我們對研究這些櫻桃品種的遺傳關系進行研究，以明確12種櫻桃品種的分類，并根據(jù)最后結果，確定出優(yōu)良的櫻桃品系，從而加快優(yōu)良品種的推廣和產量的提高。同時，本實驗有助于解決生產上存在的同物異名和同名異物的問題，為進一步開展櫻桃育種研究及生產利用奠定基礎，也將為珍貴櫻桃資源的保護與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

本實驗選用的材料為慈溪市12個本地櫻桃品系的嫩葉，研磨備用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要化學藥品和試劑 Tris-Bis、N, N’-甲叉雙丙烯酰胺、三（羥甲基）氨基甲烷、甘氨酸、TEMED、SDS、考馬斯亮藍G250、冰乙酸、甲醇等由國藥集團化學試劑有限公司生產；SDS-PAGE低分子量標準蛋白由中國科學院上海生物化學研究所監(jiān)制。

1.2.2 主要儀器和設備 電子天平BS210S、冷凍離心機、Fresco凝膠成像設備、Gel Doc EQ恒溫水浴鍋、THZ-82數(shù)顯、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ-4型等。

1.2.3 主要溶液試劑 30%丙烯酰胺貯存液、分離膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液，pH8.9）、濃縮膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液，pH6.7）、電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液，pH8.3）、1%TEMED、10%過硫酸銨（AP）、樣品溶解液、染色液、脫色液、Tris提取液。

2 實驗方法

2.1 葉片的選取

所用12個櫻桃品系的嫩葉于2009年采自慈溪市的生產果園和農家院落，分別是子陵2號、子陵1號、相公殿、黑珍珠、本地長柄、短柄2號、諸暨短柄、童岙1號、童岙2號、紅花櫻、五月櫻、下楊家。

2.2 樣品預處理

將從生產果園采摘回的不同品種的櫻桃嫩葉分別取出一部分用蒸餾水清洗幾次除去葉片表面的雜質，攤開在干凈的報紙盒中并置于45℃恒溫通風烘箱中烘數(shù)小時得到干燥的葉片。

2.3 蛋白質提取

將上述預處理所得的干燥櫻桃葉片，用電動粉碎機粉碎后放入封口塑料袋中，置于干燥器內備用。參照谷瑞升等[3]的Tris-HCl法方法并加以修改提取蛋白質：用電子天平稱取0.2 g不同品種的櫻桃葉片置于寫有標號或名稱的pv小管中，然后加入2 m L Tris提取液混勻后放置于－20℃冷凍。待樣品冷凍后取出樣品加石英砂冰浴碾磨成糊狀在4℃冰箱中靜置提取1 h，然后在4℃冷凍離心機10 000 r/min離心10 min，根據(jù)丙酮沉淀法是非常有效的蛋白質沉淀方法[4]，能夠消除瞬時的蛋白質水解作用和其他蛋白酶的修飾[5]，吸取上清液分別轉移到與之相對應的pv小管中，在上清液中加入2 m L丙酮溶液混勻后置于4℃冰箱中沉淀過夜，待蛋白質沉淀后在4℃冷凍離心機10 000 r/min離心10 min，棄上清液，再向沉淀中加入2 m L Tris提取液讓蛋白質充分溶解，然后重復上面的步驟提純蛋白質，最后將蛋白質沉淀置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１恋淼淖畲笕秉c是蛋白質很難重新溶解[6]。利用該方法從櫻桃葉片提取蛋白質產量低。

2.4 實驗步驟

2.4.1 樣品處理及加樣 各標準蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解，向處理好的待測蛋白質pv小管中加入200 μL的上樣緩沖液，準蛋白于上樣緩沖液各取15 μL按1：1的比例混合，沸水浴加熱3 min，冷卻至室溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長期存放，使用前應在沸水浴中加熱1～3 min，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。一般加樣體積為10～15 μL。如樣品較稀，可增加加樣體積。本實驗加樣體積為20 μL，用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。

2.4.2 電泳 實驗采用穩(wěn)壓電泳，設定值為：進入分離膠前為穩(wěn)壓60 V，進入分離膠后為穩(wěn)壓120 V。當溴酚藍指指示劑遷移至距下沿約1.5 cm處即停止電泳。拔掉固定板，取出玻璃板，用起膠板輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標記取出凝膠。

2.4.3 染色及脫色 將電泳好的凝膠置于裝有蒸餾水的洗膠盒中，每5 min換1次蒸餾水，清洗3次后，取出凝膠放入染色盒中，向染色盒中加入染色液，在35℃左右的恒溫振蕩水浴鍋中染色約20 min后用重復用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白區(qū)帶清晰，脫色完成后對膠板進行掃描。

3 結果與分析

3.1 實地調查分析

3.1.1 相公殿櫻桃 位于30° 16′ 23.7″ N，121° 17′ 47.4″ E，海拔3 m，果實桃形，大小1.7 cm×1.7 cm×1.5 cm，果柄長1.72 cm，果核大小1.1 cm×0.7 cm×0.8 cm，可溶性固形物含量10%。

3.1.2 童岙1號 位于30° 05′ 05.7″ N，121° 12′ 46.2″ E，海拔31 m，果實大小1.5 cm×1.4 cm×1.6 cm，果核大小0.66 cm×1.05 cm×0.82 cm，果實長圓形，縫線明顯，可溶性固形物10.5%。

3.1.3 童岙2號 生長勢中庸，口感好。

3.1.4 子陵1號 位于30° 05′ 42.4″ N，121° 11′ 09.6″ E，海拔5 m，可溶性固形物14%，果實大小1.5 cm× 1.5 cm×1.3 cm，果核大小1.0 cm×0.8 cm×0.6 cm，口感好。豐產性好。

3.1.5 子陵2號 位于30° 05′ 30.8″ N，121° 11′ 28.0″ E，海拔13 m，果實大小1.7 cm×1.5 cm×1.4 cm，果核大小0.85 cm×0.75 cm×0.6 cm，可溶性固形物15%，橙紅色，口感好，豐產性好。

3.1.6 紅花櫻桃 從嵊縣引入，果實較小，花紅色明顯區(qū)別于其他品系，其他性狀目前不明顯。

3.1.7 五月櫻 從嵊縣引入，較本地早熟品系晚10天。其他目前不明顯。

3.1.8 諸暨短柄 嵊縣引入，果實大小1.5 cm×1.47 cm×1.30 cm，核大小0.81 cm×0.56 cm×0.65 cm，可溶性固形物12%。

3.1.9 本地長柄 果實大小1.6 cm×1.6 cm×1.37 cm，果核大小0.91 cm×0.56 cm×0.71 cm，可溶性固形物13%，口感好。

3.1.10 黑珍珠 從余姚引入，果實大小1.83 cm×1.74 cm×1.80 cm，果核大小0.9 cm×0.82 cm×0.71 cm，可溶性固形物14.5%，口感好。

3.1.11 短柄2號 從余姚引入，果實大小1.5 cm×1.5 cm×1.4 cm，果核0.9 cm×0.7 cm×0.5 cm，可溶性固形物14%，口感好。

3.1.12 下楊家 位于30° 05′ 50.7″ N，121° 11′ 32.4″ E，海拔6 m，果實大小1.72 cm×1.5 cm×1.5 cm，果核大小0.9 cm×0.75 cm×0.65 cm，可溶性固形物13%，口感好。

3.2 掃描圖

使用GS-800 Calibrated Densitometer對凝膠進行掃描，得到掃描圖片（圖1，圖2）。

圖1 前6個櫻桃品系蛋白質掃描圖片F(xiàn)igure 1 Protein picture of 6C. pseudocerasusvarieties

圖2 后6個櫻桃品系蛋白質掃描圖片F(xiàn)igure 2 Protein picture of the other 6C. pseudocerasusvarieties

將電泳得到的圖譜使用GS-800 Calibrated Densitometer進行掃描，得到掃描圖運用Quantity one軟件進行分析。在Quantity one軟件中，首先進行圖像顯示優(yōu)化，如去噪點等。然后進行定量分析，得到定量分析圖譜。在定量操作中可以去除背景參數(shù)等，然后創(chuàng)建泳道和條帶進行電泳條帶分析和帶匹配操作。在電泳條帶分析功能中，創(chuàng)建定量標準。此步操作是為了在報告中得到各條帶的分子量。最后，在通過這些操作之后，在Reports和Analysis中等得各種分析報告和圖表。

3.3 蛋白質帶分析

運用Quantity one軟件，對電泳圖譜進行帶匹配操作，在完成該操作后得到了電泳條帶匹配圖譜。

圖3 前6個櫻桃品系蛋白質電泳條帶匹配圖譜Figure 3 Protein bands of 6C. pseudocerasusvarieties

圖4 后6個櫻桃品系蛋白質電泳條帶匹配圖譜Figure 4 Protein bands of the other 6C. pseudocerasusvarieties

3.3.1 相對分子質量分析 運用Quantity one軟件，輸入已知的SDS-PAGE低分子量標準蛋白的6條相對分子量14.4、20.1、31、43、66.2、97.4 KDa對帶匹配圖譜中各樣品的相對分子量進行計算。得出下圖所示的相對分子質量圖譜。

圖5 前6個櫻桃品系蛋白質相對分子質量圖譜Figure 5 Relative molecular mass of protein of 6C. pseudocerasusvarieties

圖6 后6個櫻桃品系蛋白質相對分子質量圖譜Figure 6 Relative molecular mass of protein of the other 6 C. pseudocerasus varieties

由于標準蛋白質的最大條帶的分子量為97.4 KDa，所以把大于97.4 KDa的分子條帶按相差50 KDa的蛋白質條帶劃歸為同一個蛋白條帶，把小于97.4 KDa大于10 KDa的分子條帶按相差10 KDa的分子條帶歸為同一個條帶，而小于10 KDa的蛋白質按相差3 KDa分子量的蛋白條帶劃歸為同一蛋白質條帶。根據(jù)自定的規(guī)則出樣品蛋白條帶的分布報告。

表1 不同櫻桃品種樣品條帶相對分子質量分布報告Table 1 Relative molecular weight of protein bands from differentC. pseudocerasusvarieties

3.3.2 泳道中帶分布 從表2中可以看到，12個櫻桃樣品共產生18條不同的條帶。從這18種條帶圖普中可以把樣品分為3類，其中子陵1號、黑珍珠、本地長柄、相公殿、子陵2號都有條帶5、6、7、17、18，可以大致判斷這5種品種的櫻桃屬于同一品種，親緣性比較接近；而短柄2號有條帶5、6、17、18，與子陵1號的親緣性比較接近，但跟前5種的親緣性相對比較遠一點；童岙2號、紅花櫻、五月櫻、諸暨短柄、下楊家都有條帶條帶6、10、16，可以大致判斷出這五種櫻桃屬于同一品種，親緣性比較接近；童岙1號只有條帶2和16，與上面判斷出來的兩種品種相同，因此把童岙1號單獨歸為一種品種。

表2 條帶分布報告Table 2 Distribution of protein bands

3.4 列相似性分析

Quantity one軟件提供了多種方式來比較列相似性，列相似性圖表和列相似性報表，都以最直觀的方式反映列相似性。

3.4.1 相似性圖表 從圖7、圖8、圖9、圖10中我們可以看到，電泳圖譜中各列的條帶在數(shù)量以及電泳遷移距離上的區(qū)別。

圖7 前6個櫻桃品系蛋白質列相似性圖表Figure 7 Similarity of 6C. pseudocerasusvarieties

圖8 后6個櫻桃品系蛋白質列相似性圖表Figure 8 Sim ilarity of the other 6C. pseudocerasusvarieties

圖9 相異系數(shù)Figure 9 Correlation coefficient

表3 相異系數(shù)Table 3 Correlation coefficient

3.4.2 聚類分析 根據(jù)條帶分布報告，反映的是各列（品種）之間的差異性。

從圖9和表3可看出，12個櫻桃樣品可分為3個類型，其中本地長柄、子陵1號、黑珍珠、短柄2號、相公殿、子陵2號可以歸為一類；童岙2號、紅花櫻、五月櫻、諸暨短柄、下楊家可以歸為一類；剩下的童岙1號單獨為一類。但是各個品種之間又存在一定的差異，子陵1號和黑珍珠相差0.25，本地長柄和子陵1號相差0.285 7，短柄2號和子陵2號相差0.285 7，相公殿和子陵2號相差0.3，子陵2號和子陵1號相差0.333 3，童岙2號和紅花櫻相差0.375，諸暨短柄和五月櫻相差0.375，下楊家和五月櫻相差0.375，五月櫻和童岙2號相差0.4444，童岙1號和童岙2號相差0.5，童岙1號和子陵1號相差0.545 5。

4 結論

對12個品系櫻桃葉片進行蛋白質的提取實驗，最后得到一個比較好的提取方法，即對樣品進行20 m in左右的碾磨，4℃靜置提取1 h，離心轉速10 000 r/m in。但還存在有些批次加入染色液進行電泳時出現(xiàn)了絮狀物（很可能是由于提取得到的蛋白質含量濃度過高）；在相同的處理條件下有些肉眼幾乎都看不清楚有沒有條帶；同時在后面的若干次電泳中對樣品進行了不同倍數(shù)的稀釋處理，得到的條帶不是很清楚，但拖尾現(xiàn)象還是比較明顯等問題。

得到電泳圖后使用Quantity One軟件對其進行處理分析。通過帶分析和列相似性分析，可看出不同品種間電泳條帶的區(qū)別：子陵1號、黑珍珠、本地長柄、相公殿、子陵2號這5個品種中含有5條相同條帶，不同條帶比較少，而短柄2號與這些有4條相同的條帶，故可以初步分為親緣性比較近的同一櫻桃品種；童岙2號、紅花櫻、五月櫻、諸暨短柄、下楊家這5個品種有3條相同的條帶，可以初步分為親緣性比較近的同一櫻桃品種；童岙1號與上述兩個品種相同的條帶比較少，不同條帶比較多，差異性比較大，故單獨歸為一個櫻桃品種。這個初步認定結果跟后期的聚類分析所得的結果相一致。

蛋白質條帶分析可以快速的鑒定不同品種間的親緣性關系，但是這種方法有一個比較顯著的缺點，蛋白質的提取率低。蛋白質是一種極具多樣性的生物大分子，離開其天然環(huán)境，蛋白質分子極不穩(wěn)定，將很快失去生物學活性，因此確定提取條件是一個蛋白質提取中最基本的問題。另外就是蛋白質的提取液，提取時間和離心轉速。根據(jù)摸索實驗，我們終于找到一種比較好的實驗方法：提取液選用0.4 mol的Tris-Hcl提取蛋白質，提取時間選用4℃提取1 h，離心轉速10 000 r/m in，不過做出的膠片還不理想，有待進一步研究。

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SDS-polyacrylam ide Ge l Electrophoresis Ana lysis on Protein in Cerasus pseudocerasus Leaf in Cixi

CHEN Xiao-qiang1，HUANG Shi-wen1，QIAO Jun-wei2，WANG Guo-liang2，XU Xue-quan1，XIE Guo-quan1
（1. Henghe Agricultural Center of Cixi of Zhejiang, Cixi 315318, China;
2. Zhejiang Wanli University, College of Biological & Environmental Sciences, Cixi 315100, China）

SDS- polyacrylam ide gel electrophoresis analysis was conducted on protein in 12 varieties ofCerasus pseudocerasusleaf cultivated in Cixi, Zhejiang province. Cluster analysis demonstrated that each sample had several protein bands, but had different molecular weight. The result showed that 12 varieties could be divided into three categories.

Cixi;Cerasus pseudocerasu; protein; SDS_PAGE

S662.5

B

1001-3776（2011）01-0016-07

2010-09-25；

2010-11-05

慈溪市科技局農業(yè)社會發(fā)展類科技計劃項目“中國櫻桃新品種引進與配套栽培技術研究”（CN2008010），慈溪市農業(yè)局農業(yè)科技計劃項目“中國櫻桃新品種引進與配套栽培技術研究”（200816）

陳曉強（1959－），男，浙江慈溪人，工程師，從事要果技術研究和推廣。