果糖二磷酸鈉對(duì)2型糖尿病大鼠近端腎小管功能蛋白的影響＊

劉紅 李萇清 鄭倩△

(1.川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室;2.川北醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,四川 南充 637100)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患病率近年呈快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),腎臟功能損害是糖尿病常見并發(fā)癥之一。果糖二磷酸鈉(Fructose sodium diphosphate,FDP)能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中多種酶系的活性,改善細(xì)胞缺氧、缺血的狀態(tài),延緩細(xì)胞凋亡,臨床主要用于心肌缺血、心絞痛、腦梗塞的輔助治療[1]。然而,FDP對(duì)糖尿病患者腎臟功能是否具有保護(hù)作用,特別是對(duì)腎小管中葡萄糖唯一重吸收節(jié)段-近端腎小管(Proximal tubule,PT)管周膜上的關(guān)鍵功能蛋白-鈉泵活性的影響與可能機(jī)制,目前尚未發(fā)現(xiàn)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究FDP對(duì)高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)復(fù)制的T2DM大鼠模型腎臟功能蛋白的保護(hù)作用,并探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 器材與動(dòng)物

FDP注射液(山東新華制藥,批號(hào)：0711079),STZ、Na2ATP、哇巴因、膠原酶(Sigma公司),血糖測(cè)定儀(三諾,長(zhǎng)沙),SOD、NOS檢測(cè)試劑盒(南京建成),[γ-32P]ATP(北京福瑞特公司),SN-6930A型液閃儀與SN-6100型γ計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電公司)。雄性Wistar大鼠,一級(jí),體質(zhì)量(195±16)g;高能飼料(60%常規(guī)飼料,20%蔗糖,15%豬油,5%膽固醇),均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供,動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2004-15。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組

T2DM大鼠模型的建立參照實(shí)驗(yàn)室既往方法[2],4 w高能飼料喂養(yǎng),空腹12 h后給予 25 mg?kg-1的STZ一次性腹腔注射(STZ注射前用pH=4.2的檸檬酸緩沖液配成1%濃度),繼續(xù)高能飼料喂養(yǎng) 4 w,采尾靜脈血測(cè)定空腹血糖(FBG),以FBG≥7.8 mmol?L-1作為T2DM 模型判斷標(biāo)準(zhǔn),最后選取符合條件的16只大鼠作為T2DM模型(建模成功率70%),其余淘汰。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組(n=8)：正常對(duì)照組(A);模型對(duì)照組(B);FDP治療組(C)。治療組參照文獻(xiàn)用FDP 5ml?kg-1?d-1一次性腹腔注射治療[3],對(duì)照組每次等量生理鹽水處理,在FDP治療期間,全部大鼠都用常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于FDP治療12 w末空腹12 h,1%戊巴比妥鈉30 mg?kg-1麻醉后從心臟采血制備血清標(biāo)本待測(cè),然后摘取右側(cè)腎臟,去包膜后用濾紙吸干水分后稱重,將右腎質(zhì)量與體質(zhì)量之比(KW/BW)作為腎臟肥大指數(shù)[4]。左側(cè)腎臟于-70℃凍存用于近端腎小管的微分離及其管周膜上鈉泵活性的測(cè)定。

1.3 生化及放免檢測(cè)

血糖采用血糖儀測(cè)定,SOD和NOS的檢測(cè)嚴(yán)格按照說明書采用751分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4 單根PT的獲取及其鈉泵活性測(cè)定[5]

將顯微微分離的單根PT經(jīng)過低滲凍融處理后,與1μ l總ATPase測(cè)定液或Mg-ATPase測(cè)定液37℃共同孵育15min,液閃儀測(cè)定孵育液中32Pi的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)值,利用Concet公式計(jì)算PT鈉泵活性,酶的活性單位用pmol?mm-1?h-1表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FDP對(duì)T2DM大鼠一般癥狀體征的影響

建立的T2DM模型大鼠與A組比較,體重明顯增加,并出現(xiàn)腹型肥胖和多飲,多食,多尿的癥狀,毛發(fā)色澤晦暗,精神萎靡,活動(dòng)減少,隨著病程延長(zhǎng),除大鼠體重呈下降趨勢(shì)外,其它病理癥狀逐漸加重,B組中1只大鼠可能由于高血糖繼發(fā)酮癥酸中毒而死亡;C組與B組比較,12 w后大鼠上述癥狀與病理體征明顯改善。

2.2 FDP對(duì)T2DM大鼠生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)的影響

表1可見,與A組比較,B組大鼠FBG水平與KW/BW顯著升高(P＜0.01),SOD、NOS水平顯著降低(P＜0.01);與 B組比較,FDP治療12 w后,C組大鼠FBG與KW/BW顯著降低(P＜0.01),SOD、NOS水平顯著升高(P＜0.01)。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血清生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)的變化()

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血清生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)的變化()

＊與A組比較P＜0.01,#與B組比較P＜0.01。

分組 A(8只) B(7只) C(8只)FBG(mmol? L-1) 5.08±0.46 13.35±3.42＊ 9.64±1.21#KW/BW(×10-3) 3.04±0.26 4.62±0.43＊ 3.65±0.32#SOD(U?ml-1) 120.28±13.30 85.53±9.82＊ 108.68±10.47#NOS(U?ml-1) 36.55±3.23 21.47±2.21＊ 31.54±3.12#

2.3 FDP對(duì)T2DM大鼠近端腎小管鈉泵活性的影響

如表2,與A組比較,B組大鼠12 w時(shí)PT鈉泵活性顯著降低(P＜0.01);與 B組比較,FDP治療12 w后,C組大鼠 PT鈉泵活性顯著升高(P＜0.01)。

表2 FDP對(duì)T2DM大鼠PT鈉泵活性的影響()

表2 FDP對(duì)T2DM大鼠PT鈉泵活性的影響()

＊與A組比較P＜0.01,#與B組比較P＜0.01。

分組 鈉泵活性(pmol?mm-1?h-1)A(8只) 1972±154 B(7只) 1163±105＊C(8只) 1785±126#

3 討論

糖尿病對(duì)腎臟的損害主要與持續(xù)高血糖和體內(nèi)氧化增強(qiáng)有關(guān),因?yàn)槟I臟的微循環(huán)與腎小管長(zhǎng)期直接處于高糖環(huán)境中,而且自身組織結(jié)構(gòu)薄弱,所以容易受到損害導(dǎo)致腎臟功能發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T2DM大鼠建模12 w后,血糖水平與腎臟肥大顯著升高,而體內(nèi)抗氧化能力的兩個(gè)重要指標(biāo)SOD與NOS都顯著降低,一般癥狀與體征也明顯加重。

目前研究證實(shí)FDP是細(xì)胞內(nèi)糖代謝的重要中間產(chǎn)物,能夠調(diào)節(jié)許多代謝通路,外源性的FDP通過激活磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性,使細(xì)胞內(nèi)ATP濃度顯著增加,促進(jìn)鉀離子內(nèi)流,有益于缺血、缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的能量代謝和葡萄糖的利用,從而降低血糖,保護(hù)細(xì)胞的功能。T2DM大鼠經(jīng)過FDP治療12 w后,血糖水平與腎臟肥大指數(shù)顯著降低,SOD與NOS顯著升高,糖尿病一般癥狀與體征亦明顯改善。有研究報(bào)道FDP能提高T2DM大鼠體內(nèi)的抗氧化應(yīng)急能力[6],其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,可以抑制局部組織及中性粒細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下氧自由基及組織胺等有害物質(zhì)的釋放,提高SOD活性,促進(jìn)機(jī)體對(duì)氧自由基的清除,從而減輕組織的氧化損害。

目前臨床上一般通過檢測(cè)患者尿中微球蛋白作為診斷糖尿病腎病的重要依據(jù),但是當(dāng)尿中出現(xiàn)微球蛋白時(shí),往往提示患者已進(jìn)入糖尿病腎病晚期,本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)近端腎小管管周膜上鈉泵的活性,觀察糖尿病大鼠腎臟功能的早期損害及其FDP對(duì)腎臟功能的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠12 w時(shí)近端腎小管鈉泵活性顯著降低,表明此時(shí)糖尿病大鼠腎臟功能已經(jīng)受到損害,與模型對(duì)照組比較,FDP治療組大鼠近端腎小管鈉泵活性顯著升高,表明FDP不僅能夠抑制T2DM大鼠腎臟肥大,還能保護(hù)腎小管管周膜上的功能蛋白,這些作用可能與FDP能夠降低血液粘滯度,改善局部微循環(huán)狀態(tài)有關(guān)。

總之,FDP對(duì)糖尿病大鼠腎臟功能具有明顯的保護(hù)作用,其機(jī)制與可能FDP降低動(dòng)物體內(nèi)血糖水平,改善腎臟微循環(huán)狀態(tài)和提高體內(nèi)抗氧化能力有關(guān)。

1 張惠榮,趙慧,趙莉莉,等.1,6二磷酸果糖治療新生兒缺氧缺血性腦病的臨床觀察[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2006,28(3)：182-184.

2 劉紅,羅蕾,高原.2型糖尿病大鼠近球小管 Na+,K+-AT Pase活性變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(20)：2062-2064.

3 薛瑞鳳,孫冬梅,郭淑香.果糖-1,6-二磷酸對(duì)糖尿病大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19(7)：801-802.

4 趙煥新,高原.大鼠糖尿病早期腎臟皮質(zhì)Na+,K+-AT P酶α 1-亞單位的表達(dá)[J].四川生理科學(xué)雜志,2004,26(2)：58-60.

5 高原,羅蕾,劉紅.大鼠單根近端腎小管Na+-K+-ATPase活性測(cè)定方法的改進(jìn)[J].生理學(xué)報(bào),2007,59(3)：55-57.

6 李勇,施海明,奚悅文,等.果糖二磷酸鈉對(duì)冠心病心絞痛的療效及其脂質(zhì)過氧化抑制作用[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2001,8(3)：252-254.