失血性休克的大鼠腸系膜動脈節律基因表達的變化＊

張惠琴 謝一舟 田國華 劉延友 汪宇輝 江舟 王正榮

(衛生部時間生物學重點實驗室,四川大學華西醫學中心,四川 成都 610041)

生物體內多數生理過程都存在約為24 h的周期變化,即近日節律(Circadian rhythm),近日節律是生命活動的基本現象之一[1],從簡單的單細胞動物到復雜的哺乳動物均存在近日節律。在哺乳動物中,這些基因包括 Per1、Per2、Clock、Bmal1、Cry 1、Cry 2和 Tim等[2-3]。其中Per1作為近日節律振蕩器的核心組件,不僅在近日節律的產生和調控中占有重要地位,還與免疫系統疾病和藥物依賴及腫瘤發生息息相關[5-6]。失血性休克時生理指標如呼吸、心率和血壓等重要指標的節律發生紊亂[7]。本研究以失血性休克大鼠為動物模型[8-9],初步探討其腸系膜上動脈節律基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雄性SD大鼠,4-6 w,體重250-300g,20只。控制飼養及實驗環境條件(溫度：22℃、濕度 55%、光照循環12：12),自由進食進水。

1.1.2 試劑及儀器

Trizol(Invitrogen);RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);引物序列(上海生物工程有限公司),序列見表 1。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及模型制作

SD雄性大鼠20只,實驗前禁食24 h,禁水12 h。動物隨機分為休克組和空白對照組,休克組在10min內經股動脈放血使血壓降至5.32 kPa(40 mmHg),并維持大鼠平均動脈壓在40 mmHg 30min,造模成功。正常對照組大鼠除不通過股動脈放血致休克外,其余同休克組。

1.2.2 RT-PCR檢測SMA的per1,per2mRNA的表達

實驗2 h后,處死大鼠,快速分離SMA。按 Trizol法提取組織總RNA,采用半定量RT-PCR特異性擴增 per1與per2 mRNA檢測其表達水平變化。所有反應均以GAPDH為內參照在同一擴增條件下進行。

表1 引物序列及擴增片段長度

逆轉錄反應(RT)按20 μ l體系進行逆轉錄反應,poly(A)mRNA 1 μ l,buffer 4 μ l,Oligo(dt)primer 1 μ l,10 Mm dNTP Mix 2 μ l,RNase inhibitor 1 μ l,RNA 1 μ l,加 滅 菌雙 蒸水 到20 μ l混勻,反應條件為：65℃,5min;42℃,60min;25℃,5min。

PCR擴增per1、per2基因 PCR 反應體系為 20 μ l,取 cDNA1 μ l,加入 Taq Master Mix 9 μ l,目的基因及內參照 GAPDH 上下游引物各 1.5 μ l,滅菌雙蒸水 7 μ l。擴增反應條件為：94℃預變性2min后按照94℃30 s;53℃30 s;72℃30 s共35個循環,反應結束后72℃延伸10min。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 RT-PCR產物電泳鑒定

瓊脂糖電泳鑒定大鼠失血性休克后SMA的per1、per2基因表達水平,RT-PCR產物電泳結果見圖1。用凝膠分析方法可看出休克組per1、per2比對照組per1、per2的條帶均明顯變淡。

2.2 SMA節律基因per1、per2RT-PCR產物的定量檢測

通過對休克組和對照組的per1的mRNA量的比對,可看出：與對照組相比,休克組明顯減低(如圖2),方差分析顯示差異有統計學意義(p=0.000)。通過對休克組和對照組的per2的mRNA量的比對,可看出：與對照組相比,休克組明顯減低(如圖2.2),方差分析顯示差異有統計學意義(p=0.004)。

圖1 休克組和對照組的RT-PCR產物電泳圖

圖2 SMA節律基因 per1、per2的定量檢測

3 討論

在失血性休克病理條件下per1、per2基因表達變化規律,國內外文獻尚缺乏相關報道。從基因水平探討節律基因在失血性休克的變化規律,將促進節律基因功能與失血性休克防治研究進一步深入。為此,本研究采用大鼠失血性休克動物模型,利用RT-PCR技術對腸系膜上動脈 per1、per2基因轉錄水平變化進行了探討。結果顯示大鼠失血性休克后per1、per2均顯著低于正常對照組,表明在失血性休克大鼠中節律基因表達發生明顯改變。推測 per1、per2節律基因表達明顯降低后,引起一系列重要器官的節律功能紊亂,加劇了失血性休克的發生發展過程,其具體機制有待進一步研究。

1 劉延友,王正榮.生物節律系統的研究進展[J].西部醫學,2007,19(2)：161-162.

2 Young MW,Kay SA.Time zones：a comparative genetics of circadian clocks[J].Nat Rev Genet,2001,2(9)：702-715.

3 Etchegaray JP,Lee C,Wade PA,et al.Rhy thmic histone acetylation underlies transcription in the mammalian circadian clock[J].Nature,2003,421(2)：177-182.

4 Boivin DB,James FO,Wu A,et al.Circadian clock genes oscillate in human peripheral blood mononuclear cells[J].Blood,2003,102(12)：4143-4145.

5 王躍锜,周薇,劉延友,等.節律基因Period1對嗎啡依賴效應的影響[J].航天醫學與醫學工程,2004,17(5)：383-385.

6 Murga Penas EM,Cools J,Algenstaedt P,et al.A novel cryptic translocation t(12;17)(p13;p12-p13)in a secondary acute myeloid leukemia results in a fusion of the ETV6 gene and the antisense strand of the PER1 gene[J].Genes Chromosomes Cancer,2003,37(1)：79-83.

7 陳主初主編.病理生理學[M].北京：人民衛生出版社,2001,263-295.

8 Li YC,Okuda C,Mixobe T,et al.Measurements of glucose and lactate with microdialysis probes in blood,liver and muscle of the rat during henrorrhagic shock[J].J Kyoto Pref Univ Med,1989,98(9)：931-939.

9 陳銳,劉友生,王水明.失血性休克大鼠心肌和腸上皮細胞ND1 ND2 mtTFA基因表達的變化[J].第三軍醫大學學報,2004,26(16)：1432-1435.