志賀菌臨床株耐藥性分析及對氟喹諾酮類抗生素耐藥機制的研究*

梁 帆 程玉謙 張 娜 王 俊 王淑香 郭文學 祁 偉

志賀菌是細菌性痢疾（菌痢）的病原體，是影響全球公共衛生的重要問題。上世紀70年代以來，隨著抗生素的廣泛應用，耐藥菌及多重耐藥志賀菌逐漸增多。本研究對天津地區2009—2010年分離出的志賀菌臨床株進行耐藥性分析，并對氟喹諾酮耐藥菌株的耐藥機制進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 收集分離自天津地區多家三級甲等醫院2009—2010年腸道門診患者糞便標本的志賀菌119株。經常規生化及血清凝集試驗證實，包括福氏志賀菌19株，宋內氏志賀菌 99株，鮑氏志賀菌 1株。qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr陽性菌株為本研究所保存，質粒接合試驗所用受體菌大腸埃希菌J53 AZR由上海復旦大學王明貴教授惠贈。

1.2 培養基及藥敏紙片 水解酪蛋白（MH）瓊脂購自上海伊華生物科技有限公司。藥敏紙片包括慶大霉素、鏈霉素、四環素、復方磺胺甲口惡 唑（SMZco）、阿米卡星、痢特靈（呋喃唑酮）、氨芐西林、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、萘啶酸、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星及左氧氟沙星共17種，購自北京天壇生物制品研究所。引物合成及PCR產物測序由北京六合華大基因技術有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 抗菌藥物敏感試驗 所有菌株嚴格按照CLSI2010標準，采用改良Kirby-Bauer紙片擴散法進行檢測。并對qnr、aac（6′）-ib-cr及qepA陽性供體菌、受體菌、接合菌采用微量肉糖稀釋法測定抗生素最低抑菌濃度（MIC）,質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.2 細菌總DNA的提取 采用煮沸法提取細菌總DNA作為PCR反應的擴增模板[1]。

1.3.3 氟喹諾酮耐藥菌gyrA、parC基因突變的檢測 引物gyrAF/gyrAR[2]、parCF/parCR[3]分別擴增gyrA、parC 基因片段，見表1。反應體系為25 μL，取PCR反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠系統下觀察結果。對PCR反應產物測序，結果經blast程序與GenBank數據庫公布的標準菌序列進行比對，分析gyrA、parC基因突變位點及數目與氟喹諾酮耐藥性的關系。

表1 PCR擴增反應引物序列及特征

1.3.4 qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr和qepA的基因檢測及序列分析 所有菌株采用PCR擴增qnrA、qnrB、qnrS、aac（6）′-ib-cr和qepA基因片段，反應引物設計參考文獻[4-5]，見表1。對PCR反應產物測序，結果經blast程序與GenBank數據庫公布的標準菌序列進行比對，進一步確定基因型。

1.3.5 質粒接合試驗 以喹諾酮耐藥基因（PMQR）陽性菌為接合試驗供體菌，參照Wang等[6]的方法，以耐疊氮化鈉的大腸埃希菌E.coli J53（Azide resistant）為受體菌，采用濾膜結合法進行接合試驗。取對數生長期的供體菌1.0 mL及受體菌0.5 mL菌液在1.5 mL的Eppendorf管中離心，重新懸浮后轉種到預熱好的LB瓊脂平板濾膜上，35℃孵育4~6 h，接合子以含復方磺胺甲口惡 唑（300 mg/L）和疊氮化鈉（100 mg/L）的LB瓊脂平皿上篩選，置于35℃孵育18~24 h，微量肉湯稀釋法測定供體菌、受體菌、接合菌的MIC值。

1.3.6 質粒抽提 參照文獻[7]方法，提取供體菌、受體菌、接合菌質粒DNA。對接合菌的質粒DNA進行相對應耐藥基因的PCR擴增，產物進行序列測定。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果 見表2、3。志賀菌對一代喹諾酮萘啶酸敏感率最低，其次是氨芐西林、復方磺胺甲口惡唑和四環素，3種及3種以上抗生素多重耐藥菌株接近98%。對三代頭孢菌素藥物敏感率高，未發現亞胺培南及頭孢哌酮舒巴坦耐藥株。對氟喹諾酮類藥物耐藥率低于5%，左氧氟沙星耐藥率低于2%。5株氟喹諾酮耐藥菌均為福氏志賀菌，宋內氏志賀菌對萘啶酸耐藥率高，未出現氟喹諾酮耐藥菌。

表3 5株氟喹諾酮耐藥福氏志賀菌藥敏結果[抑菌環直徑（mm），耐藥性]

2.2 gyrA、parC基因擴增結果及序列分析 5株耐氟喹諾酮志賀菌全部擴增出gyrA和parC片段，片段長度分別為648、469 bp，瓊脂糖凝膠電泳呈現均一條帶，且與目的片段大小相等，見圖1。對PCR產物進行測序，與GenBank標準菌株Blast比對，4株同時存在gyrA83、87位點及parC80位點突變，1株缺乏gyrA87位點突變，見表4。另有菌株3171 gyrA 176位點GTA（His）?GGA（Pro）突變，但位于QRDR區外。

圖1 部分氟喹諾酮耐藥志賀菌gyrA、parC基因擴增電泳圖

表4 5株氟喹諾酮耐藥志賀菌基因突變

2.3 qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr和qepA基因擴增結果及序列分析 119株志賀菌3株攜帶qnr基因和（或）aac（6′）-ib-cr基因，其中1株攜帶qnrS1基因；2株攜帶aac（6′）-ib-cr基因。未檢測出qnrA、qn?rB、qepA基因。5株經PCR檢測出現560 bp的預期條帶，經測序有2株存在304位（T→C）、535位（G→T）位點突變，確定為aac（6′）-ib-cr基因陽性株。PCR擴增qnrS、aac（6′）-ib-cr基因電泳圖，見圖2。

2.4 PMQR基因陽性菌株質粒接合試驗 3株PMQR陽性菌株中N8、F8質粒結合試驗接合轉移成功，J53接合前后受體菌及接合子的藥敏結果變化，見表5。堿裂解法提取供體菌、受體菌、接合子質粒DNA，純化并進行對應PMQR基因PCR擴增，均可擴增出目標片段，見圖2，測序與供體菌攜帶的PMQR基因序列完全一致。

表5 大腸埃希菌J53 AZR與N8、F8質粒接合前后的MIC值變化

圖2 PMQR基因陽性菌株及接合菌PCR擴增產物電泳結果

3 討論

志賀菌痢疾發病率已由1980年的8%~12%降至2008年的3%[8]，但其耐藥率尤其是多重耐藥率卻逐漸上升。本研究結果顯示近2年天津地區志賀菌痢疾的流行菌型已由福氏轉變為宋內氏為主，與國內其他地區的報道類似[9]。藥敏結果顯示，本地區志賀菌對臨床常用抗菌藥普遍耐藥，對萘啶酸、氨芐西林和復方磺胺甲口惡唑的敏感率均低于5%，對阿米卡星、呋喃唑酮敏感率相對較高。5株氟喹諾酮耐藥菌均為福氏志賀菌，耐藥率為4.2%。對三代頭孢敏感率均高于90%，未出現加酶抑制劑類及碳青霉稀類抗生素耐藥菌。

志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要包括染色體介導耐藥和質粒介導耐藥，其中染色體介導的靶位酶基因突變占主導地位。DNA解旋酶是主要作用靶位，但要形成顯著耐藥，拓撲異構酶Ⅳ基因也必須同時發生變異，且突變數目越多、范圍越大，耐藥程度也越高，尤其是涉及第2靶酶ParC[10]。本研究中5株氟喹諾酮耐藥菌耐藥程度均較高，其中N8、F44對3、4代氟喹諾酮類藥物同時耐藥。耐藥菌在gyrA、parC基因均有突變，突變株中均有gy?rA83（Ser→Leu）及parC80（Ser→Ile）位點突變，其中左氧氟沙星耐藥株N8與其余4株菌相比缺乏gyrA基因87位點突變，但攜帶質粒介導喹諾酮耐藥基因qnrS1，分析其對左氧氟沙星的耐藥性可能與之相關。其余4株菌均同時存在gyrA87（Asp→Gly、Asn）位點突變，但只有F44表現出對左氧氟沙星耐藥。此外，本研究藥敏結果顯示，菌株3171、1113、4536具有相同的基因突變表型，但對諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥程度不同，考慮存在如外排泵基因過表達等其他機制協同作用，具體原因有待進一步研究。另有菌株3171 gyrA 176位點GTA（His）?GGA（Pro）突變，但位于QRDR區外，與氟喹諾酮類藥物耐藥的相關性也有待進一步證實。

PMQR主要介導低水平耐藥，是對靶位酶突變機制的補充，但其可以借助可移動元件如整合子與ISCR等通過質粒接合、轉化等傳遞方式在不同菌株甚至不同菌群之間傳播，導致耐藥的廣泛播散。志賀菌中質粒介導喹諾酮耐藥基因包括qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr及qepA，不同地區檢出率不同。本研究共檢出3株PMQR基因陽性株，qnrS1陽性菌N8為福氏志賀菌，對氟喹諾酮耐藥；aac（6′）-ib-cr基因陽性菌均為宋內氏志賀菌，對氟喹諾酮敏感。N8及aac（6′）-ib-cr陽性菌F8成功通過質粒接合試驗將耐藥基因轉移到受體菌中，qnrS1及aac（6′）-ib-cr基因分別使受體菌對環丙沙星、氧氟沙星及左氧氟沙星的MIC增加了16、8、16倍及4、4、2倍，但都達不到臨床意義的耐藥臨界值，進一步印證了PMQR基因介導低水平耐藥的推斷，并提示qnr介導喹諾酮耐藥程度要高于aac（6′）-ib-cr。在gy?rA、parC雙基因雙位點突變的基礎上，qnrS1基因可以顯著提高N8耐藥水平，但靶位酶基因突變與qnr基因捕獲的先后有待進一步研究。

綜上，本地區近2年志賀菌主要流行菌型為宋內氏志賀菌，對多種抗生素耐藥率較高，且多重耐藥菌株比例高。對氟喹諾酮類藥物耐藥率低，且耐藥菌全部為福氏志賀菌。志賀菌氟喹諾酮藥物耐藥機制同時存在染色體介導的靶位酶突變及攜帶質粒介導的耐藥基因，但以靶位酶突變為主。

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