一種適合于PCR擴(kuò)增的真菌基因組DNA提取方法

李曉倩

(泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東 泰安 271016)

藥用真菌和藥用植物內(nèi)生真菌作為重要的微生物資源，近年來在抗腫瘤、抗菌、抗病毒［1-2］等方面發(fā)揮著越來越重要的作用，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品及生物防治等領(lǐng)域。真菌的鑒定工作是真菌資源開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，真菌的鑒定仍以形態(tài)鑒定為主，但有一些藥用真菌形態(tài)特征不易辨認(rèn)或者不易產(chǎn)生子實體，有的藥用植物內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)基中不產(chǎn)孢，這給真菌的分類鑒定工作帶來了很大的困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，提取真菌的基因組DNA進(jìn)行分子鑒定已成為真菌分類鑒定的一種重要方式。核糖體DNA上的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)是存在于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域受外界環(huán)境因素的影響較小，與編碼區(qū)域相比具有進(jìn)化速度快的特點(diǎn)，在種內(nèi)的不同菌株之間高度保守，而在真菌種間存在極大的變化，表現(xiàn)出極大的序列多態(tài)性，可以為真菌學(xué)的研究提供豐富的遺傳信息［3］，已廣泛用于藥用真菌如冬蟲夏草［4］、金耳［5］等的系統(tǒng)發(fā)育以及不產(chǎn)孢植物內(nèi)生真菌［6-7］的分類鑒定等研究。

優(yōu)化簡便易行的真菌高質(zhì)量基因組DNA提取方法將會對真菌鑒定工作提供便利。高質(zhì)量DNA要求高純度、無蛋白、糖類、酚類、鹽類等雜質(zhì)污染，高分子量、無降解和有一定的數(shù)量。藥用真菌和藥用植物內(nèi)生真菌的細(xì)胞壁都含有復(fù)雜的多糖物質(zhì)、色素以及成分不明的粘稠胞壁物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在常導(dǎo)致制備的基因組DNA樣品中帶有不同數(shù)量的多糖和其它成分，影響基因組DNA樣品的限制性酶切、連接以及PCR反應(yīng)等操作。本研究采用冷凍干燥菌絲研磨法，并在研磨過程中加入固體形式的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，然后以高濃度SDS溶液裂解細(xì)胞膜，釋放DNA，輔以20 mmol/L EDTA洗滌菌絲，有效地去除了DNA中影響后續(xù)分子操作的蛋白質(zhì)、多糖、色素及其它大分子胞壁物質(zhì)，分離到了高質(zhì)量的基因組DNA，旨在為泰山藥用真菌種質(zhì)資源保護(hù)和系統(tǒng)發(fā)育研究以及泰山藥用植物內(nèi)生真菌的多樣性和代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

泰山灰樹花(Grifola frondos)TI 購自泰安農(nóng)科院食用菌研究所;蛹蟲草(Cordyceps militaris)A1 由泰山醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供;藥用植物內(nèi)生擔(dān)子菌(plant endophytic Basidiomycetes)F1～F4 本實驗室保存菌種。

PVP 上海勝普化工有限公司;SDS 北京拜爾迪生物技術(shù)公司;β-巰基乙醇 上海生物工程技術(shù)有限公司;5 U/μL Taq DNA 聚合酶、5 mmol/L MgCl2、10× PCR Buffer和10 mmol/L dNTP Takara公司;DL 2000 PCR Marker和溴化乙錠(EB) 寶泰克生物科技有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

PTC—100基因擴(kuò)增儀 MJ公司;AllegraTM64R Centrifuge離心機(jī) Beckman;DYY—Ⅲ型電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠;顯微圖象分析儀 NIKON，E-50I;QYC-211搖床 上海福瑪試驗設(shè)備有限公司。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)(1L) 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15g，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 真菌培養(yǎng)與菌絲體收集 將灰樹花、蛹蟲草和內(nèi)生真菌活化菌種接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃、150r/min分別振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。采用真空抽濾法分離菌絲與培養(yǎng)基。菌絲體收集后，依次用無菌生理鹽水、20mmol/L EDTA、生理鹽水各洗滌一次［8］，然后置于無菌濾紙上，濾紙下鋪硅膠，風(fēng)干菌絲，即可得到干凈的菌絲體。

1.2.2 基因組DNA 提取參照程度等［9］采用的SDS法并加以修改，得到改良SDS法。(1)將-20℃冷凍的菌絲0.3 g加入固體形式的PVP(占菌絲量的2%)迅速研磨成粉末;(2)將細(xì)粉及時轉(zhuǎn)入50 mL的離心管中，加入10 mL SDS提取緩沖液輕輕旋轉(zhuǎn)混勻;(3)加入1 mL20%SDS(pH7.2)，混勻，65℃水浴保溫45 min，間或輕搖混勻;(4)加入5 mL 5 mol/L KAC，混勻后冰浴30 min，10000 r/min、4℃離心10 min;(5)取上清，加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，混勻，10000 r/min、4℃離心10 min;(6)取水相，準(zhǔn)確加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，冰上放置10 min，7000 r/min、4℃離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌，離心后溶于無菌雙蒸水中;(7)加入30 μL DNase-free RNase(10 mg/mL)，37℃溫育30 min;異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，略風(fēng)干，溶于TE中，并在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA紫外分光光度計和電泳檢測 取DNA樣品稀釋50倍后，用紫外分光光度計測量A260、A280，根據(jù)A260/A280的比值判定DNA的質(zhì)量。分別取5 μL DNA點(diǎn)樣于0.8%的瓊脂糖凝膠，5V/cm 穩(wěn)壓電泳1～2 h 后，EB 染色40 min，用水沖凈后，用凝膠成像系統(tǒng)保存圖像，分別判別DNA 分子的純度。

1.2.4 ITS序列PCR擴(kuò)增 采用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物對ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS1和ITS4的序列分別為5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?和5?-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3?。擴(kuò)增體系為:10 × PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，5 U/μL TaqDNA 酶 0.5 μL，正反向引物(10 mmol/L ITS1和ITS4)各2 μL，DNA模板4 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，，34個循環(huán);然后于72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA 提取及檢測結(jié)果

分別用SDS法和改良SDS法提取了泰山灰樹花、蛹蟲草和藥用植物內(nèi)生真菌F1～F4的基因組DNA(表1和圖1～3)，結(jié)果表明，采用SDS法提取兩種藥用真菌灰樹花和蛹蟲草DNA，其純度及產(chǎn)量均較好，但提取4種植物內(nèi)生擔(dān)子菌DNA的效果不佳，得到的DNA的A260/A280值為1.4～1.6，均低于1.65，DNA產(chǎn)量均低于70 μg/g濕菌絲;而采用改良SDS法，不管是藥用真菌還是植物內(nèi)生擔(dān)子菌獲得的DNA 顏色均呈白色、A260/A280值為1.8～1.9，DNA 產(chǎn)量為110～170 μg/g濕菌絲。電泳結(jié)果顯示:用SDS法提取的基因組DNA，點(diǎn)樣孔檢測到明顯的雜質(zhì)(圖1)，說明樣品中所含的多糖等雜質(zhì)較多。另外，蛹蟲草基因組DNA還有部分降解(圖2)，內(nèi)生真菌基因組DNA條帶不清晰，并有一定程度地彌散(圖3)。而采用改良SDS法提取的DNA條帶清晰、整齊，無彌散和拖尾現(xiàn)象，無雜質(zhì)污染，特別是4種藥用植物內(nèi)生擔(dān)子菌DNA完整，產(chǎn)量和質(zhì)量得到明顯提高。

表1 兩種方法提取的真菌DNA的純度及產(chǎn)率Table 1 The purity and yield of fungal DNAs extracted using conventional and improved SDS methods

圖3 兩種方法提取4種植物內(nèi)生擔(dān)子菌基因組DNA電泳圖Fig.3 Electrophoresis of genome DNA extracted from four isolates of plant endophytic Basidiomycetes by two extracting mthods

2.2 ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

將改良SDS法提取的灰樹花、蛹蟲草和植物內(nèi)生擔(dān)子菌基因組DNA進(jìn)行ITS擴(kuò)增分析，結(jié)果見圖4～5。PCR結(jié)果顯示，各真菌rDNA ITS序列多在500～750 bp，兩種藥用真菌灰樹花和蛹蟲草PCR擴(kuò)增條帶清晰(圖4)，4種植物內(nèi)生擔(dān)子菌F1～F4也擴(kuò)增出較清晰的條帶(圖5)，說明改良SDS法在提取富含多糖等雜質(zhì)的真菌DNA時效果良好，可用于rDNA ITS序列分析。

3 討論

高質(zhì)量DNA的快速提取是決定分子生物學(xué)實驗成敗的關(guān)鍵因素。真菌DNA提取的諸多方法中，采用SDS法具有安全、價廉、簡便、快速等特點(diǎn)，并在實驗的操作過程中不需要昂貴的實驗儀器和費(fèi)時的程序。由于藥用真菌和植物內(nèi)生擔(dān)子菌的細(xì)胞壁中含有的多糖物質(zhì)、色素以及成分不明的粘稠胞壁物質(zhì)，常規(guī)SDS法不能很好地將雜質(zhì)去除干凈，影響后續(xù)的分子生物學(xué)實驗結(jié)果。論文在參考前人的工作基礎(chǔ)上，采用改良SDS法成功地快速提取了藥用真菌和植物內(nèi)生真菌基因組DNA，關(guān)鍵在于作者對SDS法做了以下幾方面改進(jìn):

(1)低溫干磨，并在研磨過程中加入固體形式的PVP。真菌細(xì)胞壁破碎，一般都強(qiáng)調(diào)用溫和方法，盡量避免機(jī)械法，經(jīng)多次實驗表明，低溫下研磨省事而無影響，但研磨不要超過10 min，而且要迅速加入裂解緩沖液，否則，研磨過程中釋放出蛋白質(zhì)和DNA酶會降低DNA的提取率。PVP在溶液中有非常良好的浸潤能力，在植物DNA的提取中它主要與多酚類化合物結(jié)合，避免多酚類化合物介導(dǎo)的DNA降解［10-11］。在本研究中我們借鑒PVP在植物基因組DNA提取中的作用，用于除去真菌中的多酚及成分不明的胞壁物質(zhì)等雜質(zhì)，效果良好。

(2)根據(jù)高濃度SDS有利于去除多糖［12］這一特點(diǎn)，將SDS濃度提高到20%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖的去除效果很好。

(3)本研究還對溫浴時間進(jìn)行了延長，由原來的30 min改為45 min，并隔一段時間輕搖幾下，試驗結(jié)果表明，該改進(jìn)使得從真菌材料中提取的DNA純度有明顯的提高。其原因應(yīng)該是溫浴時間加長使得其反應(yīng)更加徹底，更有利于PVP以及提取緩沖液對于雜質(zhì)的去除。

(4)研究中我們還發(fā)現(xiàn)，供試的植物內(nèi)生擔(dān)子菌發(fā)酵液特別粘稠，即使加入了酚:氯仿:異戊醇以后，也難以得到清液，加入乙醇沉淀后得到不同程度的白色粘性沉淀，難溶于TE，電泳檢測發(fā)現(xiàn)含量也較低，可能是因為樣品本身含有某種不易去除的膠狀物質(zhì)。通過真空抽濾法收集菌絲，然后用20 mmol/L EDTA洗滌菌絲，有利于去除菌絲中的多糖、色素和其它大分子胞壁物質(zhì)，再結(jié)合改良SDS法可明顯提高植物內(nèi)生真菌基因組DNA的質(zhì)量，所提取的DNA 能用于PCR 等生物技術(shù)領(lǐng)域，適用于藥用植物內(nèi)生真菌的分類鑒定和遺傳多樣性分析。

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