APP5肽類似物P165和羅格列酮對SH-SY5Y細胞IRS-1和p-CREB表達的影響

張景燕 王 蓉 趙靜姝 姬志娟 趙志煒 盛樹力

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，老年病醫療研究中心，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

散發性老年性癡呆(sporadic Alzheimer disease，SAD)是一種常見的神經系統退行性疾病，其主要臨床表現為進行性認知功能下降和行為異常。腦內糖代謝障礙可以引起認知功能受損，而AD病人也常伴有腦內糖代謝障礙［1］。AD 發病的關鍵因素Aβ的產生及分泌與糖代謝障礙之間有非常密切的關聯，并且可以相互促進［2］。胰島素通過與細胞膜上的胰島素受體(insulin receptor，IR)相結合，通過胰島素信號轉導過程，調控細胞內特定的生理生化反應。近年越來越多的研究［3］表明，腦內胰島信號轉導通路異常在SAD的發生、發展過程中具有重要作用。

胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(phosphated-cAMP response element binding protein，p-CREB)是胰島素信號轉導通路中的關鍵環節［4］。在以往的系列研究［5-6］中發現，本課題組自行設計合成的APP5肽類似物P165以及胰島素增敏劑羅格列酮具有明確的神經保護作用，并可能與其改善胰島素的信號轉導有關。本實驗應用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)損傷人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞模型，觀察APP5肽類似物P165和羅格列酮對胰島素信號通路相關因子IRS-1和p-CREB表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1)細胞株:人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫學院。

2)試劑:鏈尿佐菌素購自Merck公司，羅格列酮購自葛蘭素史克公司，APP5肽類似物P165由本室自行設計，固相法合成，高效液相色譜純化(HPLC)。

IRS-1、p-CREB抗體由本室合成多肽片段，經HPLC純化后與血蘭蛋白交聯，免疫兔獲得抗血清。山羊抗兔IgG/Dylight購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1)細胞培養:用含10%胎牛血清的MEM培養基，于37℃ ，5%CO2培養箱中培養，6 d傳代1次，中間換液1次。

2)細胞實驗:將生長良好、傳代穩定的SH-SY5Y細胞以2×103/mL的密度接種于48孔板(Nunc產品)，每孔體積500 μL，48 h后分為4組進行實驗。包括:對照組、STZ神經元損傷模型組(STZ 0.8 mmol/L)、羅格列酮保護組(STZ 0.8 mmol/L+羅格列酮20 μmol/L)，APP5肽類似物 P165保護組(STZ 0.8 mmol/L+P165 30 μmol/L)，各組細胞數及培養液體積均相等。

3)培養細胞形態觀察:倒置顯微鏡下觀察培養的細胞，比較實驗組和對照組細胞的形態。

4)免疫細胞熒光染色:將生長良好、傳代穩定的SH-SY5Y細胞以2×103/mL的密度接種于48孔板(Nunc產品)，每孔體積500 μL，當細胞生長至70%～80%匯合率時，終止培養。PBST洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBST洗5 min×3次，5%山羊血清封閉1 h，分別加入一抗，即IRS-1抗體(1∶200)、p-CREB抗體(1∶200)。4 ℃過夜，PBST洗5 min×3次，滴加相應的二抗(1∶200)，常溫避光反應2 h，PBST洗5 min×3次，熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。用顯微圖像分析系統對各組進行圖像分析，每組隨機選取300個細胞，采用image-pro plus圖像分析軟件測量平均吸光度(OA)值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，結果以中位數(M)和四分位數(P25，P75)表示，因數據為非正態分布資料，故采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗，組間兩兩比較校正后檢驗水準α為0.008，以P＜0.008為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態觀察

接種后的SH-SY5Y細胞呈單個細胞，密度均勻漂浮在培養液中，體積較小、圓形、透亮，24 h貼壁后細胞長出較長突起，呈梭形、不規則的三角形或多邊形。至第3天與對照組相比，STZ損傷組細胞生長分裂減慢、突起縮短，細胞胞體皺縮。APP5肽類似物P165保護組和羅格列酮保護組突起伸展，細胞形態和細胞胞體皺縮現象與STZ損傷組相比有所改善。

2.2 IRS-1和p-CREB抗體的免疫細胞熒光染色

IRS-1和p-CREB抗體免疫熒光染色后，細胞呈淡綠色熒光，說明SH-SY5Y細胞中存在IRS-1和p-CREB的表達。與對照組相比，STZ損傷組細胞熒光強度較弱，而P165保護組和羅格列酮保護組細胞熒光強度較強(圖1，2)。

平均吸光度值測定結果顯示:與對照組相比，STZ損傷組IRS-1和p-CREB平均吸光度值降低(P＜0.008)，與STZ損傷組相比，P165組和羅格列酮組平均吸光度值有所上升，差異均有統計學意義(P＜0.008)(表1，2)。

表1 APP5肽類似物P165和羅格列酮對STZ損傷人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞IRS-1表達的影響Tab.1 Effects of P165 and rosiglitazone on the expression of IRS-1 in SH-SY5Y

表2 APP5肽類似物P165和羅格列酮對STZ損傷人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞p-CREB表達的影響Tab.2 Effects of P165 and rosiglitazone on the expression of p-CREB in SH-SY5Y

3 討論

SH-SY5Y細胞來源于人神經母細胞瘤，其細胞形態及生理、生化功能與正常神經元相似，并且存在胰島素受體和胰島素信號通路相關蛋白，已廣泛用于神經生物學的研究［7］，因此，我們應用 STZ損傷 SHSY5Y細胞的胰島素受體，制備神經元胰島素信號通路障礙的損傷性模型，從而觀察與老年性癡呆發病機制密切相關的胰島素信號轉導通路關鍵蛋白的變化。

APP5肽類似物P165是本課題組自行設計合成、并進行結構改造的小分子神經營養肽，前期工作［6，8］證明，其具有改善腦內胰島素抵抗、保護神經細胞的作用。本研究通過細胞形態的觀察以及免疫細胞熒光染色的分析，探討在胰島素受體損傷導致胰島素信號轉導障礙情況下，胰島素信號轉導相關蛋白IRS-1和p-CREB表達的變化，并進一步觀察APP5肽類似物P165對上述指標的干預作用，結果表明，P165可以提高IRS-1和p-CREB的表達，改善神經元生長狀態。

羅格列酮(rosiglitazone)屬噻唑烷二酮類化合物(thiazolidinediones，TZDs)，作為胰島素增敏劑，可增加組織細胞對胰島素的敏感性，降低胰島素抵抗［9］。Pedersen W A等［10］觀察了羅格列酮對Tg2576小鼠(一種AD的轉基因動物模型)的作用，發現治療6周，雖不能改變淀粉樣斑塊的病理變化，但可以選擇性地降低腦Aβ42的水平，本課題組的前期工作也發現其具有保護神經元的作用［5］。在本次實驗中，同樣觀察了此藥物對胰島素信號轉導蛋白的影響，結果顯示，羅格列酮可以改善IRS-1和p-CREB的表達水平。

綜上所述，本課題組自行設計的APP5肽類似物P165及胰島素增敏劑羅格列酮可能通過增加IRS-1、p-CREB的表達來改善STZ對于SH-SY5Y細胞的損傷，從而達到保護神經元的作用。

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