口蹄疫病毒抗原決定簇融合基因轉(zhuǎn)化苜蓿

王鳴剛，羅茂春，彭軼楠，盧 真，陳 亮

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.龍巖學院生物系，福建 龍巖 364012；3.廈門大學生命科學學院，福建 廈門 361005)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的烈性傳染病，主要感染偶蹄目動物，患病動物在消化道的皮狀粘膜、口、舌、唇、蹄間隙和蹄冠緣、乳房及皮膚的其他無毛發(fā)處等部位發(fā)生水泡和潰爛。人和非偶蹄動物也可感染此病，但癥狀較輕。由于豬、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成大規(guī)模地流行，所以國際獸疫局將該病列為A 類家畜傳染病之首[1]。

1989年美國科學家在煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等植物上成功地制造了乙肝疫苗、大腸埃希菌疫苗，用這些植物喂飼小鼠后，均產(chǎn)生了預防接種的效果,引起了植物學、微生物學、免疫學、分子生物學等方面專家的極大興趣和關注[2]。自第1例轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗出現(xiàn)以來,很多植物疫苗已問世,并在動物和人體內(nèi)進行了臨床試驗。結果表明,植物疫苗在預防感染性疾病、治療腫瘤和自身免疫病等方面是可行有效的[3]。

轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應器生產(chǎn)口服疫苗，以其獨特的優(yōu)越性迅猛發(fā)展，其研究和應用開辟了植物生物技術的新天地。轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗將成為生物制藥的重要發(fā)展方向[4-6]。

口蹄疫病原為口蹄疫病毒，屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是目前所知病毒中最細微的一級，具有7種不同的血清型。7 種不同血清型可根據(jù)核酸同源性大小分為兩群：O、A、C 和Asia I 為第1群，SAT1、SAT2、SAT3 為第2群。群內(nèi)各型同源性達60%～70%，但兩群之間同源性僅為25%～40%，各血清型間無血清交叉和交叉免疫現(xiàn)象，各個血清型又包括多個亞型[7]。O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，我國流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型[7]。

本試驗通過農(nóng)桿菌介導的方法將口蹄疫抗原決定簇融合基因O21-O14-A21-HBcAg轉(zhuǎn)入苜蓿(Medicagosativa)品種甘農(nóng)1號中，希望獲得轉(zhuǎn)基因植株。從中選出高表達口蹄疫抗原決定簇融合基因的植株，期望通過免疫動物獲得對口蹄疫病毒的免疫應答。

1 材料與方法

1.1材料 甘農(nóng)1號苜蓿品種由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。農(nóng)桿菌株EHA105由蘭州理工大學植物細胞與分子生物學實驗室保存。pCAMBIA1301 雙元載體，含T-DNA左右邊界序列、植物抗性篩選標記HPT、抗性標記NPT-Ⅱ、報告基因GUS以及多克隆位點(MCS)，由澳大利亞CAMBIA實驗室提供。O型和A型口蹄疫抗原決定簇融合基因(O21-O14-A21-HBcAg)植物表達載體(pCAMBIA1301-O21-O14-A21-HBcAg)由蘭州理工大學植物細胞與分子生物學實驗室構建，結構如圖1所示。

圖1 融合基因O21-O14-A21-HBcAg植物表達載體結構

植物誘導(繼代)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基(B5H)：B5+2,4-D 0.1 mg/L+KT(Kinetin)0.1 mg/L；篩選培養(yǎng)基(B5HHT1)：B5+2,4-D 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+Hyg(潮要素)1 mg/L+Timentin 300 mg/L；誘導胚性愈傷組織培養(yǎng)基(B5HHT2)：B5+2,4-D 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+Hyg 1 mg/L+Timentin 200 mg/L；分化培養(yǎng)基(B5HT)：B5+Hyg 1 mg/L+Timentin 100 mg/L；誘導生根培養(yǎng)基(1/2MSHT)：1/2MS(蔗糖10 g/L)+Hyg 1 mg/L+Timentin 100 mg/L。

1.2方法

1.2.1苜蓿再生系統(tǒng)的建立 取出芽兩周的實生苗葉片作為外植體，平鋪至B5H培養(yǎng)基中。繼代一次后將愈傷組織轉(zhuǎn)至B5培養(yǎng)基中誘導體胚的分化，兩周繼代一次，在淡黃色(或黃綠色)愈傷組織上長出綠點。待胚狀體長成魚雷狀且可清晰地辨認單個胚狀體時，將其單個分離并轉(zhuǎn)至新的B5培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待胚狀體發(fā)育成小苗并有少數(shù)根后，將小苗移植到1/2 MS生根培養(yǎng)基中誘導生根，移植20 d后統(tǒng)計根生長情況。

1.2.2苜蓿愈傷組織對潮霉素的基礎抗性測定 將苜蓿的愈傷組織放置于含不同潮霉素(Hygromycin，Hyg)質(zhì)量濃度的B5H培養(yǎng)基上，觀察其生長狀況20 d，進而確定最佳潮霉素抗性篩選質(zhì)量濃度。

1.2.3轉(zhuǎn)化、篩選和潮霉素抗性植株的再生 取新鮮苜蓿葉片，在B5H中預培養(yǎng) 4 d，待農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600約0.6時，取1 mL菌液加到9 mL MS液體培養(yǎng)基中混勻；將經(jīng)過預培養(yǎng)的葉片加入到上述混合液中，放置20 min。取出侵染后的葉片組織，置于B5H培養(yǎng)基中，暗處共培養(yǎng)4～5 d后取出葉片，轉(zhuǎn)移到B5HHT1培養(yǎng)基中篩選。將篩選20 d后的葉片組織轉(zhuǎn)至B5HHT2培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，并在B5HT中誘導分化；分化培養(yǎng)基中分化出小苗后將再生苗移植到1/2 MSHT中誘導生根。然后，移植到營養(yǎng)缽中繼續(xù)生長。

1.2.4組織化學及分子生物學方法檢測 GUS基因(與口蹄疫基因構建在一起的轉(zhuǎn)入基因)活性的組織化學染色檢測，參照王關林和方宏筠[8]的方法。

PCR檢測與分析：融合基因O21-O14-A21-HBcAg全長900 bp。通過Primer Premier 5軟件對融合基因內(nèi)部序列設計引物，兩條引物之間約540 bp。

5′端引物：5′-TGCCTTCTGACTTCTTTCC-3′；3′端引物：5′-CCTGCCTCGTCGTCTAAC-3′。

PCR反應條件為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性45 s，52 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸5 min。

2 結果與分析

2.1甘農(nóng)1號愈傷組織形成及分化情況 甘農(nóng)1號葉片外植體接種于B5H培養(yǎng)基中，于25 ℃、14 h/d光照條件下培養(yǎng)誘導愈傷，20 d后取其中7個重復組統(tǒng)計愈傷數(shù)，出愈率為95.2%。有65個外植體分化出了綠點，分化率達61.9%，分化時間(即愈傷組織上形成第1個綠點所需的時間)為25～35 d。

2.2潮霉素的質(zhì)量濃度對苜蓿葉片愈傷組織形成的影響 結果表明，在0.5 mg/L的選擇壓下，抗性愈傷組織形成情況與對照組無明顯差異。隨著潮霉素質(zhì)量濃度的提高，愈傷組織逐漸變黃，長勢明顯減弱。當潮霉素質(zhì)量濃度為1 mg/L時，20 d后葉片單個外植體部分褐化死亡，部分正常長出愈傷組織，長出的愈傷組織相對于對照組稍小且黃；當潮霉素質(zhì)量濃度加到2 mg/L時，20 d后葉片基本枯黃，多數(shù)不能正常形成愈傷組織(表1)。因此，可確定以甘農(nóng)1號葉片作為轉(zhuǎn)化材料，其愈傷誘導分化潮霉素的選擇壓力為1 mg/L。

表1 不同選擇壓力對苜蓿葉片愈傷組織形成的影響

2.3抗性愈傷組織的篩選及其再生植株的獲得 取出在B5H培養(yǎng)基中預培養(yǎng)4 d的葉片，將其同農(nóng)桿菌菌液混合侵染20 min，經(jīng)過在B5H培養(yǎng)基上5 d的共培養(yǎng)后，接種于B5HHT1培養(yǎng)基上進行篩選。經(jīng)約10 d，葉片部分枯黃，某些區(qū)域開始突起形成抗性愈傷組織(圖2A)，20 d后愈傷組織基本覆蓋葉片。在B5HHT2培養(yǎng)基上繼代一次后轉(zhuǎn)至B5HT培養(yǎng)基上，約兩周后抗性愈傷長出綠色的芽點(圖2B)，并很快的分化成芽。將芽分離置于新的B5HT培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過25～30 d芽逐漸長出葉片，并在基部分化出根(圖2C)。最終形成植株52株，出芽率49.5%，其中生根的植株有48株，生根率達到45.7%(圖2D)。

2.4組織化學及分子生物學方法檢測

2.4.1GUS基因在轉(zhuǎn)化后的愈傷組織中的瞬時表達檢測 轉(zhuǎn)化愈傷(葉片)組織在培養(yǎng)30 d后，取抗性愈傷組織進行GUS基因組織化學染色檢測，轉(zhuǎn)化愈傷組織塊表面部分呈現(xiàn)藍色斑點(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)基因苜蓿再生過程

圖3 GUS基因在轉(zhuǎn)化愈傷中的瞬時表達(右邊為陰性對照)

2.4.2PCR檢測結果 以抗性植株葉片分別提取的基因組總DNA為模板，用前面所述引物進行PCR擴增(圖4)，結果表明，抗性植株擴增出長度約為540 bp條帶，與陽性對照一致，而陰性對照(未轉(zhuǎn)化植株)未擴增出任何條帶。表明目的基因O21-O14-A21-HBcAg已整合到轉(zhuǎn)化植株的染色體基因組中。在隨即檢測的7株農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化再生植株中，有4株呈陽性反應，陽性率為57.1%。

圖4 轉(zhuǎn)基因抗性植株PCR擴增結果

3 討論

3.1基因型對愈傷組織的形成與分化的影響 愈傷組織的形成受到外植體供體的基因型、培養(yǎng)基成分、外界環(huán)境等諸多因素的影響，是個復雜的過程。然而，在苜蓿的組織培養(yǎng)中，王鳴剛等[9]先前的研究結果表明苜蓿葉片形成愈傷組織的能力同基因型關系并不大。在本研究中，曾嘗試對隴東等其他品種進行愈傷誘導，發(fā)現(xiàn)隴東苜蓿在B5H培養(yǎng)基中極不容易形成愈傷，與前人的研究結果[10-11]有不相符之處。

苜蓿愈傷組織的形成大致可分為誘導、細胞分裂和細胞分化3個過程。本研究發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的長勢與分化能力并無必然關聯(lián)。愈傷組織有可能單極瘋長，卻并不分化。也有愈傷組織表面分化的綠點不斷地細胞分裂，但沒有進一步分化成莖葉等結構。而一些葉片，特別是經(jīng)過潮霉素篩選的葉片，初期會枯萎，在20多天后才開始形成愈傷組織并進一步分化出胚體。在分化能力方面，各個基因型間存在顯著差異(結果未列出)，甘農(nóng)1號是最適合的再生體系的品種。

3.2潮霉素對抗性再生的抑制 確定選擇壓力的要求是：選擇性抗生素的濃度既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長，使之慢慢死亡，又不能對受體植物細胞有嚴重的毒性，影響轉(zhuǎn)化細胞的正常生長分化。多數(shù)研究者采用一步法，即在整個愈傷誘導、分化及生根過程中采用相同的篩選壓，篩選壓多選擇半致死濃度，降低抗生素對轉(zhuǎn)化細胞的損害，但是篩選效率較低。多步篩選法是在外植體最初誘導形成愈傷的幾周采用較低的篩選壓，等愈傷長到一定程度后，提高抗生素的濃度[12]。也有人采用篩選壓濃度先高后低的方法[13],多步法篩選得到的再生苗陽性率較高，但采用先低后高的篩選壓容易產(chǎn)生嵌合體，先高后低則由于開始篩選壓過高，多數(shù)細胞無法正常生長、分化而降低再生率。轉(zhuǎn)基因苜蓿研究中通常采用Austin等[14]建立的一步法，本試驗在愈傷形成、分化及生根過程中均使用1 mg/L的潮霉素作為篩選壓，初步結果表明陽性率接近50%，篩選效率較高。但在該質(zhì)量濃度下，再生苗生根明顯受到抑制，根生長緩慢且很少有根毛的分化，這可能是由于根組織相對于葉片對潮霉素敏感性更高。

3.3預培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染時間及共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響 預培養(yǎng)可促進細胞分裂，分裂狀態(tài)的細胞更易整合外源DNA，從而提高外源基因的短暫表達和穩(wěn)定整合率。陳晨等[15]對預培養(yǎng)影響苜蓿的轉(zhuǎn)化效率的研究表明，預培養(yǎng)5 d抗性愈傷的形成率及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率都最高。本試驗在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化前，對葉片進行4～5 d的預培養(yǎng)。

農(nóng)桿菌侵染外植體時間及共培養(yǎng)時間都會影響轉(zhuǎn)化效率。在侵染過程中，一方面要使農(nóng)桿菌充分接觸葉片，另一方面又要將細菌對植物組織的傷害降低到最小。陳晨等[15]的研究表明，苜蓿葉片侵染20 min時瞬時表達率及抗性愈傷形成率最高。參考不同學者的研究方法，本試驗選擇農(nóng)桿菌侵染時間為20 min。

農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)在整個轉(zhuǎn)化過程中是非常重要的環(huán)節(jié)，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這一時期內(nèi)完成。農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16 h后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這一段時間被稱為“細胞調(diào)節(jié)期”[16-17]。因此，共培養(yǎng)的時間必須大于16 h，時間太短不能實現(xiàn)T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合。但如果共培養(yǎng)的時間太長，農(nóng)桿菌過度增殖會使外植體受到毒害甚至死亡，同時后續(xù)試驗中農(nóng)桿菌也不易被清除。本試驗發(fā)現(xiàn)，一般共培養(yǎng)4 d的農(nóng)桿菌就開始大量生長，繼續(xù)培養(yǎng)不利于后面葉片的抑菌培養(yǎng)和分化。因此，本試驗采用共培養(yǎng)3～5 d后除去葉片表面的農(nóng)桿菌，置于含Timentin的培養(yǎng)基中誘導愈傷的形成。

3.4抗性苗再生過程中的植株異型現(xiàn)象 本試驗發(fā)現(xiàn)，從愈傷組織分化出的胚體細胞可進一步分化形成葉片狀結構，但該“葉片”較正常植株的葉片更加粗厚，且體積相對較大。這些異化的結構在經(jīng)過一段時間后有些可以在原有結構上重新長出正常的植株，但是植株與未被農(nóng)桿菌侵染的正常再生苗相比顯得纖弱。這種情況下，要形成正常的植株往往要經(jīng)歷更加漫長的時間。因此，本試驗對這些材料提供的培養(yǎng)基漸次降低潮霉素和抗生素的濃度，以縮短出苗時間。

3.5轉(zhuǎn)單一抗原與融合抗原基因植物的比較 Dimarchi等[18]用合成FMDV VP1 141～158和200～213片段氨基酸組成的40個氨基酸肽(半胱氨酸-半胱氨酸-200～213-脯氨酸-脯氨酸-絲氨酸-141～158-脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸)，在其中間加上兩個脯氨酸和一個絲氨酸，使多肽折成立體構型，大大提高了單段肽(141～158-脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸)在豚鼠中的應答水平，并提出了N-末端氨基酸(半胱氨酸-半胱氨酸)在提高保護應答中的重要性。Brown[19]用化學法合成了FMDV VP1基因編碼的140～160及200～213位肽段的基因片段，并在大腸桿菌體內(nèi)得到了表達，用其免疫牛、豬等都獲得了較好的免疫力。Doel 等[20]根據(jù)FMDV A、O、C三型的VP1序列分別合成了含各型病毒VP1蛋白的141～158和200～213片段氨基酸殘基的多肽。分別將各多肽與油佐劑混合接種牛和豚鼠上，誘導產(chǎn)生了高水平的抗同型病毒和抗接種肽的抗體，并且針對A型和O型FMDV合成的多肽接種的實驗動物能抵抗同型病毒的攻擊，但C型效果較差。由于我國流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型[7]，綜合前人試驗結果，本試驗構建O型和A型口蹄疫特異抗原決定簇融合基因(O21-O14-A21-HBcAg)植物表達載體，并以此轉(zhuǎn)化苜蓿，期望表達特異抗原，進行特異保護。

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