毒素脅迫對紫莖澤蘭揮發物的影響

張紅玉，楊 斌，何月秋

(1.貴州師范大學生命科學學院,貴州 貴陽 550001; 2.西南林業大學 云南省高校森林災害預警與控制重點實驗室,云南 昆明650224; 3.云南農業大學植物病理重點實驗室,云南 昆明650201)

植物為了有效地保護自身免受病蟲害的侵害而經長期進化產生了一系列化學防御物質。其中，當植物遭受病原菌侵染、昆蟲取食、化學因子、機械損傷時均能造成某些揮發性組分(volatile organic compounds,VOCs)的大量釋放[1-3]。在各類揮發性組分當中，不少組分具有抑菌抑蟲活性，可能充當了直接阻止、抵御病原菌侵染或昆蟲取食的化學防衛因素；有的組分是植物防衛基因表達的高效調節子；還有的組分是植物自身或植物間傳遞信息的化學信號分子，例如植物報警信號(warning signal)、引誘捕食性或寄生性天敵信號(guiding signal)[4]。作為植物次生代謝產物，這些揮發物在提高植物自身保護和生存競爭能力、協調與環境的關系中充當著重要的角色[5]，對植物的化學防御起到重要的作用并具有重要的生態學意義[6-7]。

隨著研究的深入，人們對揮發物產生、釋放及其在植物化學防御中的作用機制已有越來越多的認識，尤其對于蟲害誘導產生的植物揮發性化合物(herbivore-induced plant volatiles，HIPVs)的代謝調控機制已進行了大量研究[8]，但對于病原菌毒素脅迫下植物揮發性組分的研究還比較少。紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)揮發性化合物本身具有抑菌活性[9]，但松針褐斑病菌(Lecanostictaacicola)毒素脅迫對于紫莖澤蘭揮發性組分及其化學防御有何影響尚不清楚。本研究測定該毒素脅迫對紫莖澤蘭揮發性組分的影響，探討毒素脅迫對紫莖澤蘭化學防御可能存在的影響，以期為進一步闡明松針褐斑病菌毒素對紫莖澤蘭的傷害機理和惡草抗性問題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試雜草：紫莖澤蘭采自西南林業大學校園內。

供試病原真菌：松針褐斑病菌由福建沙縣官莊林場嚴重感病的濕地松(Pinuselliottii)松針上分離得到。經分離、純化，菌種保存于西南林業大學微生物實驗室。

試驗儀器：氣相色譜-質譜聯用儀(GS-MS，FINNIGAN TOP 8000/VOYAGER)、水蒸氣蒸餾提取器。

1.2試驗方法

1.2.1供試松針褐斑病菌毒素粗提溶液的制備 參照楊斌等[10]的方法，具體步驟如下：

1)病原真菌產毒培養：挑取經PDA擴繁10 d后的菌絲，接種于已滅菌并裝有 250 mL PD培養液的三角瓶中(每個三角瓶接種菌絲塊大小基本一致)，置于搖床上，轉速120 r/min，25 ℃下振蕩培養25 d。用墊有雙層濾紙的布氏漏斗真空抽濾培養物，濾去菌絲即得毒素原液。

2)毒素粗提溶液制備：取毒素原液100 mL，置于真空旋轉蒸發儀內，60 ℃下抽真空旋轉將水分蒸干。然后，分3次共加入300 mL氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿∶甲醇=2∶3)，40 ℃下振蕩提取30 min,重復3次以便提取充分。合并3次提取液，在40 ℃下經真空旋轉蒸去有機溶劑，蒸干后得毒素粗提物，置于4 ℃冰箱中保存備用。用無菌水將毒素粗提物配制成2.5 mg/mL的溶液，作為供試毒素粗提液。

1.2.2供試雜草材料的初處理 自無病蟲害的紫莖澤蘭植株摘取生長均勻一致的葉片，先用自來水沖洗，再用濾紙吸干水分，混合均勻，待用。從以上葉片中，稱取130 g紫莖澤蘭新鮮葉片(樣品A)；再稱取130 g，置于2.5 mg/mL毒素粗提液中，浸泡48 h后，濾去毒素粗提液，葉片用蒸餾水沖洗干凈，為毒素脅迫紫莖澤蘭離體葉片(樣品B)。取一定量的紫莖澤蘭植株，插于2.5 mg/mL毒素粗提液中，48 h后，采下葉片，稱取130 g，為毒素脅迫紫莖澤蘭植株的離體葉片(樣品C)。

1.2.3揮發油的提取 采用蒸餾萃取法分別對3種不同處理的葉片材料進行揮發油的提取，萃取溶劑為石油醚。把材料放入蒸餾萃取裝置一端的500 mL圓底燒瓶中，用電熱套加熱；裝置的另一端為盛有25 mL石油醚的100 mL圓底燒瓶，在60 ℃下水浴加熱[11]。同時蒸餾萃取4 h，再蒸去石油醚，得到具有濃烈香味的淺黃色揮發油，樣品A、B和C的收油率分別為0.20%、0.89%和0.19%。

1.2.4揮發油的氣相色譜-質譜聯譜分析 GC-MS分析測試條件為，色譜柱HP-5MS(60 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣He；流速1 mL/min；進樣溫度240 ℃；接口溫度250 ℃；質譜掃描范圍為35～455 amu；離子源EI源；電子能量70 eV。

2 結果與分析

3種不同處理方法得到的揮發性成分的氣相色譜-質譜聯譜分析總離子流圖分別見圖1(186個峰)、圖2(259個峰)、圖3(232個峰)。以相似度>80，相對含量>0.1%為數據處理標準，排除一些可信度不高、含量極少的物質。

2.1不同樣品所產生揮發物的組分差異 經數據處理，樣品A、B、C產生的揮發物組分數分別為39、60、53個，樣品B為樣品A組分數的近1.54倍，樣品C為樣品A組分數的近1.36倍，說明松針褐斑病菌毒素脅迫可誘導紫莖澤蘭離體葉片產生更多的揮發物組分。其中，受毒素脅迫紫莖澤蘭離體葉片較受毒素脅迫紫莖澤蘭植株的離體葉片產生的揮發物組分數更多。

樣品A、B、C產生的揮發物當中，相對含量大于2%的主要組分各有6個、11個、9個。以樣品B所產生揮發物的主要組分最多，其次為樣品C，樣品A相對最少。結果表明，與新鮮離體葉片相比，受毒素脅迫后，紫莖澤蘭離體葉片不僅產生了更多種揮發物組分，而且相對含量超過2%的主要組分的個數也增至新鮮葉片的1.83倍和1.50倍。

不同樣品所產生的揮發物主要組分及其含量明顯不同(表1)，僅α-紅沒藥醇(α-Bisabolol)是不同樣品中唯一共有的主要組分，但在不同樣品中的含量有差異。α-紅沒藥醇在樣品A、B、C所產生揮發物當中的相對含量分別為7.19%、4.60%、5.08%，表明新鮮葉片中的α-紅沒藥醇明顯高于該揮發物在受毒素脅迫離體葉片和受毒素脅迫植株的離體葉片當中的相對含量，由此顯示出受毒素脅迫后，紫莖澤蘭離體葉片所產生的α-紅沒藥醇相對含量較新鮮葉片有不同程度的減少。另外，在樣品A和樣品B中，α-紅沒藥醇是相對含量最高的組分；在樣品C中，它的相對含量僅略次于乙酸冰片酯。前人研究[12]表明，α-紅沒藥醇具有廣譜抗菌作用，也是雞血藤(Caulisspatholobi)等多種植物的揮發物當中相對含量較高的組分。乙酸冰片酯是樣品B和樣品C共有的揮發物主要組分，且相對含量均超過4%，但該組分不存在于樣品A當中，是受毒素脅迫后才產生的主要組分。

受脅迫離體葉片和受脅迫植株離體葉片產生的揮發物的組分及其相對含量存在差異，這可能與受毒素脅迫的部位不同有關，進一步的可能性原因是：紫莖澤蘭不同部位在受到毒素脅迫后產生揮發物的時間、途徑各不相同，最終造成揮發物的組分及其相對含量因受脅迫部位不同而出現差異。

以往的研究[13-14]表明，不同真菌毒素的除草活性、作用位點、作用機制、致病機理各不相同，結合本研究結果，可以推斷：毒素脅迫雜草的方式不同或者部位不同，直接影響到雜草合成組分各異、相對含量不同的揮發物。因此，如果進一步研究毒素脅迫對雜草化學防御的作用機制或調控機制，很可能有助于為人們尋求新的雜草除控策略提供新思路。

圖1 新鮮葉片內揮發物GC-MS分析總離子流

圖2 毒素脅迫離體葉片內揮發油GC-MS分析總離子流

圖3 毒素脅迫植株葉片內揮發油GC-MS分析總離子流

2.2不同樣品所產生脂肪類、芳香類和萜類揮發物的差異 經GC-MS測試分析，紫莖澤蘭揮發性化合物的基本化學組成為脂肪族化合物、萜類化合物和芳香族化合物(表2)。這幾類植物揮發性物質大多具有抑菌、殺菌或殺蟲活性[15-20]，或者可以作為植物抵御病原菌侵染的防衛因子及信號分子[7]。

與樣品A相比，受毒素脅迫后，不論是樣品B，還是樣品C，脂肪族類和萜類組分數均增加，萜類組分的增加尤其明顯，與此相反，芳香族類組分減少(表2)。

芳香族化合物(含有苯環)屬于碳環化合物(含有完全由碳原子組成的環)；萜類化合物是具有(C5H8)n通式以及其含氧和不同飽和程度的衍生物，可以看成是由異戊二烯或異戊烷以各種方式連結而成的一類天然化合物；脂肪族化合物，又稱為直鏈化合物，其結構特點是碳與碳間連接成不閉口的鏈。從某種意義上說，毒素脅迫后揮發性化合物雙鍵比例減少，是還原反應的結果，揮發性成分大量被還原，顯示有另外的物質發生了氧化反應。

表1 不同樣品中揮發物的主要組分及其相對含量

表2 不同樣品中各類揮發物的數量差異

3 討論

前人研究[21-22]表明，由松針褐斑病菌產生的毒素不僅是寄主松科植物的致病毒素，而且屬于非寄主專化性毒素，能使空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)、稗草(Echinochloacrusgalli)表現出明顯的傷害癥狀，生長受到抑制。此外，該毒素對外來入侵雜草紫莖澤蘭的脅迫研究表明，毒素脅迫能引起紫莖澤蘭過氧化氫酶(catalase)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)等6種抗病相關酶活性發生變化[23]，能誘發紫莖澤蘭葉片電解質滲漏[24]，誘發鈣和鉀等礦質元素滲漏[25]，從而影響紫莖澤蘭對病蟲害的化學防御能力。

已有文獻報道[26-28]，紫莖澤蘭具有化感作用，本研究通過對松針褐斑病菌毒素脅迫下紫莖澤蘭葉片氣相色譜-質譜聯用儀的分析證實了這一點。同時發現，毒素作用后紫莖澤蘭揮發物的成分明顯增多，其中脂肪族類和萜類化合物數量增多，而芳香族化合物數量減少，這不僅說明松針褐斑病菌毒素脅迫可誘導紫莖澤蘭產生更多的具有抗病蟲活性的揮發性化合物，而且還預示著遭受毒素脅迫后，紫莖澤蘭葉片內出現了劇烈的生理生化反應。過去，從酶的角度證實過毒素脅迫能引起植物發生異常的生理生化反應，本研究從小分子代謝產物角度也證實這種異常反應的存在，化合物差異的巨大還說明，毒素影響的可能不止是某個反應鏈，而是整個反應系統。

從某種意義上說，松針褐斑病菌毒素脅迫后紫莖澤蘭揮發物雙鍵比例減少，這也從終產物的角度闡明該毒素誘發紫莖澤蘭氧化反應，與過去認為毒素作用后植物活性氧含量增加的結論一致。病原菌侵入植物后可誘導活性氧的爆發，并且，活性氧在病原菌與植物的非寄主互作中較之在寄主互作中的積累更明顯，活性氧的爆發已被認為是寄主防衛反應之一[26]。某些活性氧可以充當信號分子，在植物遭受病原菌的初始侵染后傳遞信號，從而使植物組織產生一系列的抗病防御反應[27-28]。當然，植物體內包括酶在內的很多物質對活性氧迸發都有重要影響[29]，即便不同的溫度條件對活性氧代謝的影響也有所差異[30]。盡管毒素脅迫后紫莖澤蘭體內活性氧代謝變化的真實情況尚待測定，而且活性氧迸發可能是多種活性氧總體的反應結果，但本研究至少從另一個側面說明松針褐斑病菌毒素脅迫不僅關系到對紫莖澤蘭抗性的影響，而且還關系到在紫莖澤蘭與病蟲害互作過程中起作用的其他因子或環節。

作為植物重要的化學防御途徑，揮發性次生代謝產物在保護植物免遭病原菌、昆蟲的侵染中發揮了重要作用。植物揮發性化合物的組成和含量受到植物不同基因型和化學型、不同發育時期，以及不同環境因子的影響[31-32]，這些差異與植物化學防御的關聯值得進一步研究。另外，植物揮發性物質是多種復雜組分的混合物，植物抵御病原菌和植食性昆蟲的策略亦是多組分協同作用的結果。因此，開展外來入侵雜草揮發性化合物的合成途徑、調控機制、影響因素等方面的研究，進一步闡明揮發物在雜草化學防御反應中的作用，對研究和尋找除控雜草的有效途徑具有指導意義。

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