不同含水量紫花苜蓿種子衛星搭載后植株葉片保護酶活性的研究

馬學敏，張治安，鄧 波，張蘊薇，高洪文，龐瑩瑩，楊世超，劉 蒙

(1.吉林農業大學,吉林 長春 130118; 2.中國農業大學動物科學學院草地研究所,北京100193；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

航天誘變育種又稱空間誘變育種，是指利用衛星、飛船等返回式航天器或高空氣球將植物種子、組織、器官或生命個體搭載到宇宙中，利用太空特殊的環境(空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素)使種子產生變化，引起生物體染色體畸變，進而導致生物體遺傳變異，經地面種植選育新種質、新材料，培育新品種的植物育種新技術[1-2]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草之一，具有較高的經濟價值。因其具有高蛋白、強固氮能力等優點，被冠以“牧草之王”的美譽[3]。目前關于苜蓿空間誘變方面的研究主要集中在發芽率[4]、株高[5]、過氧化物同工酶[6]、細胞學效應[7-9]等方面。但在抗氧化酶及相關物質等生理方面的研究鮮見報道。以不同種子含水量紫花苜蓿衛星搭載后與未搭載的種子生長的植株葉片為研究對象，通過對保護酶活性及丙二醛含量的測定，探討航天誘變對其抗氧化酶系及相關物質的影響，以及種子水分含量對空間誘變結果的影響，為選育新的抗性品種提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1材料 供試材料為紫花苜蓿“中苜一號”種子，經衛星搭載后第一代(SP1)第3年齡植株。材料由中國農業大學草地研究所提供。

1.2方法

1.2.1種子水分預處理 參考韓建國[10]的研究方法，將原始含水量為9%的供試牧草種子分為5份,每份2.5 g。將待處理的種子裝入鋁箔袋中，按公式計算出使含水量達到9%、11%、13%、15%和17%時分別應加的水量，含水量計算公式如下:

W2=W1×(100-A)/(100-B)

式中，A為種子初始含水量(%);B為所要達到的含水量(%);W1為稱取的種子質量(g);W2為種子加水后質量(g);所需加水量(mL)為W2-W1。

用微量注射器將所需的水量分別注入鋁箔袋中，封口后輕微晃動使種子與水均勻混合，水平置于25℃恒溫培養箱中24 h。

1.2.2衛星搭載處理 將經過處理的種子分為兩份，一份種子封入布袋進行搭載(SP)，“實踐八號”育種衛星于2006年9月9日在酒泉衛星發射中心升空，衛星在近地點187 km、遠地點463 km的近地軌道運行，于9月24日返回地面。另一份作地面對照(CK)，貯存于地面溫濕度相近(20℃左右)的環境中。2008年5月將兩份種子在實驗室中發芽，6月移栽到中國農業大學上莊試驗站。于2010年4月底，以當代(SP1)第3年齡植株為試驗對象，在分枝期取植株中上部葉片作為試驗材料，測定葉片超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶 (POD)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.3測定方法 SOD、CAT、POD活性的測定：稱取葉片0.5 g，放入預冷的研缽中，加入1 mL預冷的酶提取液(50 mmol/L的磷酸緩沖液，pH值7.8)，研磨成勻漿，加緩沖液使終體積為5 mL。在4℃條件下以12 000 r/min離心15 min。取上清液定容至5 mL，取其中1 mL稀釋至10 mL后用于CAT及POD的測定，未稀釋溶液用于SOD的測定。SOD活性采用NBT法[11]測定，以抑制NBT光化還原50%作為1個酶活單位(U)；CAT活性采用紫外吸收法[11]測定，以每分鐘內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)；POD采用愈創木酚法[11]測定，以每分鐘內A470變化0.01為1個酶活性單位(U)。MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[11]測定。

1.4數據分析 試驗數據使用SPSS 17.0統計軟件進行顯著性分析，并用Excel做圖。

2 結果與分析

2.1空間誘變對植株SOD活性的影響 地面對照組(CK)之間相比，隨著種子含水量的增加，植株葉片的SOD活性呈先下降后上升的變化，種子含水量為13%和15%的植株葉片SOD活性分別比9%的SOD活性降低78.33%和82.78%，差異顯著(P<0.05)(圖1)。衛星搭載組(SP)之間相比，隨搭載種子含水量升高其植株葉片的SOD活性呈先升高后降低的變化，搭載種子含水量11%、13%和15%的植株葉片SOD活性比搭載9%的SOD活性分別提高33.16%、38.45%和36.32%，差異顯著(P<0.05)。衛星搭載與地面對照組相比，種子含水量為11%、13%、15%和17%衛星搭載植株葉片的SOD活性分別比相對應種子含水量地面對照組的植株葉片的SOD活性提高61.49%、571.79%、735.48%和38.96%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為11%、13%和15%衛星搭載植株葉片的SOD活性分別比種子含水量9%地面對照組的植株葉片SOD活性提高40.56%、45.56%和43.89%，差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同含水量紫花苜蓿種子衛星搭載后植株葉片SOD活性的變化

2.2空間誘變對植株CAT活性的影響 地面對照組之間相比，隨著種子含水量的增加，植株葉片的CAT活性呈下降變化，種子含水量為15%和17%的植株葉片的CAT活性分別比9%的CAT活性降低61.78%和59.24%，差異顯著(P<0.05)(圖2)。衛星搭載組之間相比，隨搭載種子含水量升高，其植株葉片CAT活性呈先升高后降低的變化，搭載種子含水量13%的植株葉片的CAT活性比搭載9%的CAT活性提高44.77%，差異顯著(P<0.05)。衛星搭載與地面對照組相比，種子含水量為9%、11%、13%、15%和17%衛星搭載植株葉片的CAT活性分別比相對應種子含水量地面對照組的植株葉片的CAT活性提高30.36%、30.43%、104.19%、264.44%和140.63%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為13%和15%衛星搭載植株葉片的CAT活性分別比種子含水量9%地面對照組的植株葉片的CAT活性提高85.99%和39.28%，差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同含水量紫花苜蓿種子衛星搭載后植株葉片CAT活性的變化

2.3空間誘變對植株POD活性的影響 地面對照組之間相比，隨著種子含水量的增加，植株葉片的POD活性呈先下降后升高的變化，不同水分含量間雖有差異，但變化不明顯，只有13%含水量顯著低于15%和17%含水量的種子(P<0.05)(圖3)。衛星搭載組之間相比，隨搭載種子含水量升高其植株葉片的POD活性呈先升高后降低又升高的變化；搭載種子含水量13%和17%植株葉片的POD活性比搭載9%的POD活性分別提高47.99%和52.10%，差異顯著(P<0.05)。衛星搭載與地面對照組相比，種子含水量為9%、13%、15%和17%衛星搭載植株葉片的POD活性分別比相對應種子含水量地面對照植株葉片的POD活性提高45.29%、252.66%、54.85%和82.65%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為13%、15% 和17%衛星搭載植株葉片的POD活性分別比種子含水量9%地面對照的植株葉片POD活性提高115.01%、76.72%和120.99%，差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同含水量紫花苜蓿種子衛星搭載后植株葉片POD活性的變化

2.4空間誘變對植株MDA含量的影響 地面對照組之間相比，隨著貯藏種子含水量的增加，植株葉片MDA含量呈先上升后下降的變化，種子含水量為13%植株葉片的MDA含量比9%的MDA含量升高15.35%，差異顯著(P<0.05)。衛星搭載組之間相比，隨搭載種子含水量升高，其植株葉片的MDA含量呈先降低后升高的變化，搭載種子含水量13%和15%的植株葉片MDA的活性比搭載9%的MDA含量分別降低29.89%和13.45%，差異顯著(P<0.05)(圖4)。衛星搭載與地面對照組相比，種子含水量為13%和15%衛星搭載植株葉片的MDA活性分別比相對應種子含水量地面對照組的植株葉片MDA含量降低40.54%和25.06%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為13%和15%衛星搭載植株葉片的MDA含量比種子含水量9%地面對照組的植株葉片MDA含量降低31.42%和15.33%，差異顯著(P<0.05)。MDA的變化與保護酶的變化相一致。

圖4 不同含水量紫花苜蓿種子衛星搭載后植株葉片MDA含量的變化

3 討論與結論

本研究得出，地面對照組植株的保護酶活性及丙二醛含量在水分的影響下呈負效應，降低了植物的抗氧化能力。在空間誘變條件下，搭載種子植株的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的酶活性增強，丙二醛含量降低，說明衛星搭載后紫花苜蓿的抗氧化能力提高。這與Xue等[15]研究結果一致，其研究結果表明空間處理后月季(Rosachinensis)組培苗葉片中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的活性均有所增加，而丙二醛的含量下降。尚晨等[12]在利用高能混合粒子場的地面模擬試驗中，也指出輻射增強了M2代的超氧化物歧化物酶的活性。

另外在本研究中，空間環境下不同含水量種子的植株所產生的誘變效應并不一致，這可能與空間的復雜環境(微重力、零磁空間、宇宙射線)相關。試驗結果表明，超氧化物歧化酶在11%、13%和15%處理時誘變效應增強；過氧化氫酶在13%的處理效應最強；過氧化物酶則在13%和17%的處理下誘變效應最大；丙二醛的誘變效應在13%和15%下最強，且丙二醛含量的變化與保護酶活性的變化相一致。這說明植物種子較高水分含量可以促進空間誘變效應的強度，但種子水分過高時誘變效應又會減弱。任衛波等[13-14]在研究中得出空間環境處理后新麥草(Psathyrostachysjuncea)株高、生殖枝數、單株種子產量顯著增加，種子千粒重降低；種子含水量對空間環境誘變效果有顯著影響，當種子水分接近10%時，誘變效應減弱；當種子水分>10%時，誘變效應開始增強；空間環境對新麥草二代種子發芽能力、種苗生長、種子浸出液電導率有顯著影響，具體變化因品種而異；當種子含水量為10%～12%，誘變效應減弱，當含水量偏離這一范圍時，誘變效應增強。以上說明種子含水量對空間誘變效應有一定的影響，可能是因為種子含水量改變了種子的生理狀態，使其處于休眠向萌動過渡時期，增加了空間誘變敏感性[13,16]。但其機理目前尚不清確，還有待進一步的研究。

綜上所述，空間誘變對植株的抗逆性可產生正效應的結果，并在含水量13%、15%時達到最大的誘變效應，可作為新品種選育的研究手段，進一步進行研究。但這種變化是純生理的還是遺傳學物質的改變引起的，還需要進一步深入的研究。本研究的結果可以為進一步深入的研究奠定基礎，以期為選育出新的、穩定的品種提供參考。

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