IBA處理對厚葉扇子花扦插苗生根關聯酶活性的影響

劉玉民，劉亞敏，徐娜婷，何丙輝

(西南大學資源環境學院 西南大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715)

厚葉扇子花(譯名)(Scaevolacrassifolia)，英文名Thick-leaved fan flower，是草海桐科草海桐屬植物，澳大利亞特產。其特點是多年生、生長快、適應性較強、易養護，種植當年即開花，花量大、花期長、花形特別，是澳大利亞花卉市場的重要種類，并已在歐洲和北美引種成功，深受消費者喜愛，作為地栽和盆栽花卉被廣泛栽植于廣場、庭院、陽臺等地，極具市場前景和經濟價值。Scaevola屬植物因其花呈扇子形而被統稱為扇子花，2007年作為國家林業局“948”引進項目被引種到我國進行試驗栽培，厚葉扇子花為其中的1個種，但由于其種子發芽率極低，用種子繁殖比較困難，引種后一直未能在我國進行大面積推廣。扦插繁殖方法能夠有效解決某些用種子繁殖困難的植物快速繁育問題，為了使澳大利亞特色花卉厚葉扇子花能在我國快速繁殖和推廣，豐富我國的花卉資源種類，本研究探討IBA處理對厚葉扇子花扦插生根的影響，分析扦插生根過程中過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等關聯酶活性變化，旨在為確定正確的厚葉扇子花無性扦插快繁技術提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1扦插試驗 厚葉扇子花插穗來源于西南大學溫室大棚內種子繁殖的植株(作為國家林業局“948”引進項目，2007年西南大學等項目承擔單位從澳大利亞引進的種子，種子發芽率僅為4%)。扦插試驗于2009年5月初在西南大學溫室大棚內進行，在厚葉扇子花母株上剪取粗約0.3 cm的側枝，摘去下部葉片，保留3～4片上部葉片和頂芽，剪成長度為8 cm的插穗，下切口平剪，扦插前用質量濃度為250 mg/L的IBA溶液浸泡2 min，對照用蒸餾水浸泡2 min。扦插基質為珍珠巖、紫色土、腐殖土的混合基質(體積比為1∶1∶1)。插后保持溫室遮光率為60%左右，相對濕度控制在70%～80%，溫度控制在20～30℃，按照需要進行噴霧處理，常規管理。扦插試驗采用完全隨機區組設計，3次重復，每個區組將對照及用IBA處理的插穗各插200條，3個區組總計扦插1 200條。

1.2取樣及樣品處理 扦插后每隔4 d采樣一次，每個測定指標均在3個區組各隨機取5株，采樣后洗凈吸干，先觀察其生根情況，然后取插穗基部3 cm皮部分別測定其POD、SOD、CAT、PPO和IAAO等酶的活性，進行3次重復測定。

1.3測定方法 PPO活性采用李忠光和龔明[1]改進的方法測定，取1.0 g插穗基部皮層放入研缽中，加入1 mL預冷的磷酸緩沖液(pH值7.8)研磨，再加1 mL緩沖液，傾入5 mL離心管，于4℃ 10 000 r/min條件下離心20 min，上清液即為酶液。反應體系為3 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚(用pH值7.8的磷酸緩沖液配制)，1 mL酶液，以滅活的酶液為空白對照，30℃下水浴10 min，立即用20%三氯乙酸中止反應，5 000 r/min下離心10 min，于410 nm處測定其吸光值。POD活性采用愈創木酚法、SOD活性采用NBT光氧化還原法、CAT活性采用滴定法測定[2]，IAAO活性用比色方法測定[3]。

PPO以每克鮮樣品每分鐘A410光密度變化0.01個單位所需要的酶液量作為一個活力單位(U)，POD以每分鐘內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)，SOD以抑制NBT光氧化還原50%的酶量為一個酶活性單位(U)，CAT以每克鮮樣品每分鐘內分解1 mg過氧化氫為1個酶活力單位(U)；IAAO以每克鮮樣品在1 h內分解破壞IAA的毫克數表示1個酶活性單位(U)。

1.4數據分析 用DPS統計軟件進行數據分析，顯著性檢驗采用雙因素方差分析，多重比較采用最小顯著極差法(LSD)，利用EXCEL繪圖。

2 結果與分析

2.1厚葉扇子花扦插苗生根特性 觀察厚葉扇子花生根過程形態變化發現(表1)，無論是用IBA處理的插穗還是對照插穗下切口開始出現愈傷組織的時間均在扦插開始后8 d左右。部分插穗扦插后基部能形成愈傷組織，開始只出現一些半透明的、不規則的瘤狀突起物，后來有些形成環狀，這些插穗多數都能繼續生根；部分插穗基部不能形成愈傷組織并出現皺縮現象，但仍能繼續長出不定根；少數插穗基部完全被團狀的愈傷組織包圍，這類插穗生根數較少或不生根，但也不立即枯死，有些還能繼續抽稍、展葉；少數插穗基部發黑，這類插穗往往最終死亡，極少數基部發黑的插穗上端能長出不定根。經IBA處理的插穗有45%能長出愈傷組織且能繼續生長膨大，而對照插穗只有20%能長出愈傷組織且多數不能繼續膨大。經IBA處理的插穗扦插后，第12天開始形成不定根，第30天時生根率為89%，不定根條數范圍為2～46條，平均不定根條數為25條，生根植株最大根長為3.4 cm，平均根長為1.3 cm。對照插穗扦插后，第14天開始形成不定根，第30天時生根調查顯示生根率為62%，不定根條數范圍為1～30條，平均不定根條數為13條；生根植株最大根長為2.9 cm，平均根長為0.9 cm。多數厚葉扇子花扦插苗不定根是從插穗基部3 cm范圍內的皮部長出，極少數從愈傷組織處長出，且生根優良的插穗愈傷組織發育往往較弱，因此厚葉扇子花扦插苗應為皮部生根類型。

表1 厚葉扇子花扦插苗生根特性

2.2厚葉扇子花扦插生根過程相關酶活性變化

2.2.1POD活性變化 POD是植物對膜脂過氧化酶促防御系統中重要的保護酶，主要起到酶促降解H2O2的作用[4]。POD的活性與離體植物生根有密切關系，是植物生根標志性物質之一[5]，其作用的某些產物是不定根發生和發展所必須的輔助因子，能促進不定根的形成[6]。在不定根誘導期和表達期，POD活性升高是有生根能力的標志[7-8]。厚葉扇子花扦插生根過程中POD活性成規律性變化(圖1)，經IBA處理的插穗和對照插穗POD活性在扦插初期均升高，且均在10 d左右達到高峰，之后開始下降，處理插穗POD活性在扦插15 d后基本穩定，對照插穗扦插20 d后基本穩定。處理與對照插穗中POD活性差異顯著(P<0.05)，表明激素處理能提高插穗的POD活性，這種活躍的生理狀態對生根有利，在生根的不同階段POD活性有顯著變化(P<0.05)。

圖1 厚葉扇子花扦插過程種POD活性變化

圖2 厚葉扇子花扦插過程種SOD活性變化

2.2.3CAT活性變化 CAT酶在體內的主要作用是清除H2O2，有效地保護細胞免受損傷[11]。厚葉扇子花扦插生根過程中CAT活性成規律性變化(圖3)，經IBA處理的插穗和對照插穗基部CAT活性在扦插初期均降低，隨著不定根的凸出和生長又開始升高，最小值出現在扦插后10 d左右。經IBA處理的插穗CAT活性比對照降低的更明顯，且在整個扦插生根過程中始終低于對照。經IBA處理的插穗與對照插穗中CAT活性有顯著差異(P<0.05)，在生根的不同階段CAT活性有變化但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 厚葉扇子花扦插過程種CAT活性變化

2.2.4PPO活性變化 PPO能催化酚類物質和IAA形成一種“IAA-酚酸復合物”[12]，這種復合物具有促進不定根形成的活性[13]，PPO還能催化生長素的代謝，促進不定根的起源與發育[14]。厚葉扇子花扦插生根過程中PPO活性均表現為扦插初期上升，達到最大值后開始下降(圖4)。處理與對照插穗中PPO活性高峰期出現的時間不同，經IBA處理的插穗在扦插后15 d左右達到高峰，而對照插穗在扦插后20 d左右達到高峰。處理與對照插穗中PPO活性差異不顯著(P>0.05)，在生根的不同階段PPO活性有顯著差異(P<0.05)。

圖4 厚葉扇子花扦插過程種PPO活性變化

2.2.5IAAO活性變化 IAA是一種植物生長素，能促進不定根的發生與發育，而IAAO能降解IAA，調節植物體內的IAA含量，影響植物的生長發育，因此IAAO活性的大小與根的發生有重要關系[15]。厚葉扇子花扦插生根過程中IAAO活性均表現為先降低后升高的趨勢(圖5)。經IBA處理的插穗IAAO活性最小值出現在扦插后15 d左右，對照插穗出現在扦插后20 d左右。經IBA處理的插穗IAAO活性比對照降低的更明顯，且在整個扦插生根過程中始終低于對照，處理與對照插穗之間IAAO活性差異顯著(P<0.05)，在生根的不同階段IAAO活性有顯著差異(P<0.05)。

圖5 厚葉扇子花扦插過程種IAAO活性變化

3 討論與結論

厚葉扇子花屬于皮部生根類型，用適宜濃度的IBA處理厚葉扇子花插穗能提高其生根率和根系質量。過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等活性酶均與厚葉扇子花生根過程有密切關系，直接影響植物的生根特性。IBA處理明顯改變了厚葉扇子花插穗內過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的活性，且在生根過程中成規律性變化，其中過氧化物酶、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶活性在扦插后逐漸升高，在根系形成期達到高峰，然后又逐漸下降；過氧化氫酶和吲哚乙酸氧化酶活性表現為先降低后升高的趨勢，在根系形成期達到最小值。

植物體內的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等酶之間存在密切的關系，具有許多共同特征，有些過氧化物酶同工酶具有吲哚乙酸氧化酶活性，有些具有多酚氧化酶的活性[16]；而有些植物體內吲哚乙酸氧化酶也具有過氧化物酶的性質[17]。過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶活性高低可作為判定植物生根難易的指標之一，吲哚乙酸氧化酶是調節IAA含量的重要酶，而IAA的一個非常重要的生理功能就是促進不定根的形成。因此，吲哚乙酸氧化酶通過氧化IAA來控制植物的生根狀況。相關研究認為，一些植物離體生根的誘導期內高活性的吲哚乙酸氧化酶使內源IAA水平降低，低濃度的IAA有利于生根，在表達期吲哚乙酸氧化酶活性降低使得植株內源IAA含量升高，高濃度的IAA能促進根的生長[5,7,18-21]。本研究中，厚葉扇子花插穗體內吲哚乙酸氧化酶的變化表現為根系誘導期較高、表達期較低、生長期又升高的趨勢，與相關研究結論一致；有研究認為，過氧化物酶，也能氧化IAA，從而調節植物生根能力[22]，當植物體內的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶活性較高時，降解IAA的作用強，IAA被破壞較多，對誘導生根不利。當植物體內的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶活性較低時，降解IAA能力較弱，對誘導根原基的形成有利。而本研究中，過氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶活性變化趨勢并不相同，這說明過氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶對植物生根的聯合影響具有復雜性，可能因物種不同而異，有待于進一步深入研究；植物體內的酚類物質對不定根的起源和發育起著極其重要的作用[20]，多酚氧化酶能催化酚類物質與IAA縮合而形成一種“IAA-酚酸復合物”[12]，這種復合物是一種生根的輔助因子，具有促進不定根形成的活性[13]。在不定根形成時，體內的酚類物質含量會下降，被認為這是由于酚類物質在多酚氧化酶的作用下轉變的結果。因此，多酚氧化酶是影響不定根形成的一個重要因素。而本研究中，不定根形成期多酚氧化酶含量達到高峰，與前人研究的結論一致。雖然過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等活性高低直接影響不定根的形成，但也不能僅憑植物的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等活性高低就判定植物生根的難易，因為生根是插穗內激素種類和相對比例、生根抑制劑的存在與否、插穗內營養物質含量等多種因素綜合作用的結果。

植物從扦插開始到生根完畢會受到很多逆境脅迫的影響，插穗內會產生大量自由基和活性氧，對植物造成很大傷害，過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶是保護酶系統的重要組成成分，能夠在一定程度下清除體內過剩的活性氧和自由基[23-24]，影響植物的生根質量。有研究表明一些植物扦插生根過程中過氧化物酶活性會出現兩個高峰值[18-19,22,25]，而本研究中厚葉扇子花在整個生根過程中只出現了一個峰值，這與前人[18-19,22,25]對其他植物的研究結果不同，可能是由于厚葉扇子花屬于皮部生根類型，所需生根的時間較短引起的，但這種推測還有待進一步深入研究。

IBA能促進植物體內過氧化物酶、多酚氧化酶、吲哚乙酸氧化酶等酶的活性變化，從而促進細胞的脫分化，產生愈傷組織。本研究從生根過程中相關氧化酶變化方面揭示了厚葉扇子花生根的生理響應機制，但由于影響植物扦插生根的因素較多，只有對插穗內營養物質含量、內源激素水平等與生根相關指標的變化規律進行詳細研究后，才能更確切地闡明厚葉扇子花的生根機理。

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