箭筈豌豆甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因片段的克隆及序列分析

張 磊,劉志鵬,張吉宇,張妙青,王彥榮

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

高等植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)可以分為兩個亞類，一類存在于細胞質(zhì)基質(zhì)，由同型的4個GapC亞基構(gòu)成，以NAD(H)為輔酶，是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶之一；另一類存在于成熟葉綠體中，由GapA和GapB兩種亞基構(gòu)成，以NADP(H)或NAD(H)為輔酶，參與光合作用Calvin循環(huán)中的能量固定過程[1-3]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性與生物體能量代謝過程密切相關(guān)，它廣泛參與了植物以及真菌對低溫，高鹽，干旱，熱激以及病害等逆境脅迫的生理及病理響應(yīng)過程[4-8]；GAPDH基因在進化上具有保守性，因此也常被用作判定植物親緣關(guān)系的依據(jù)[1]。

箭筈豌豆(Viciasativa)是豆科野豌豆屬植物，具有較高的營養(yǎng)價值和較強的抗寒特性[6]，是適宜在高寒高海拔地區(qū)栽培的優(yōu)良牧草。先前的研究表明，箭筈豌豆品系2505，2556和2560在我國青藏高原地區(qū)經(jīng)過多年馴化[7]，其后代已經(jīng)表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳特性和良好的生產(chǎn)性能[8-9]，具有進一步的育種潛力。引種后代與原種相比，包括抗逆特性在內(nèi)的多種指標均發(fā)生了顯著變化[10]，同時過氧化物酶同工酶酶帶暗示了短期馴化過程中分子水平上的改變[9]。然而，目前對箭筈豌豆的分子生物學(xué)研究尚不深入，關(guān)于箭筈豌豆GAPDH基因，尤其是它在作物高寒適應(yīng)過程中的作用研究鮮見報道，這在很大程度上限制了基因工程在箭筈豌豆育種中的應(yīng)用。有鑒于此，本研究開展有關(guān)箭筈豌豆GAPDH基因的克隆研究，為箭筈豌豆未來的育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 箭筈豌豆采用引進品系2560，在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗地盆栽，采集幼嫩莢果，液氮處理后于-80℃超低溫保存。

1.1.2試劑 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)， PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)，DNA凝膠回收試劑盒，pGM-T克隆試劑盒，DH5α感受態(tài)細胞，DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由北京賽百盛生物工程公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計 檢索NCBI上已公布的植物GAPDH基因序列信息，選取與箭筈豌豆親緣關(guān)系較近物種的GAPDH蛋白序列進行比對找出高度同源區(qū)域，用Primer Premier 5.0進行引物設(shè)計[9]。確定一對引物：P1(正向引物)：5′TCTCACTCTTTCCCAACTCAAT 3′，P2(反向引物)：5′TGTCATACCAAGCAACCACC 3′，預(yù)測片段長度為1 141 bp。

1.2.2RNA總量的提取 參照RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)使用說明提取箭筈豌豆幼嫩莢果總RNA，產(chǎn)物用紫外分光光度計進行純度測定，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性[10]。

1.2.3RT-PCR擴增 cDNA第一鏈合成參照PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)使用說明，PCR反應(yīng)體系50 μL：10×PCR Buffer 5 μL；dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL；Ex Taq HS(5 U/μL)0.5 μL；引物P1和P2各1 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，然后以94℃ 30 s，58℃ 30 s ，72℃ 1 min進行30個循環(huán)，于72℃延伸10 min，取5 μL 擴增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4陽性克隆的篩選與鑒定 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠回收后克隆在pGM-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過藍白斑篩選挑取陽性克隆，經(jīng)過PCR鑒定后送上海生工進行測序。

1.2.5序列的生物信息學(xué)分析 序列翻譯，比對通過DNAMAN軟件進行，在NCBI(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站上進行Blast檢索[11]，用MEGA 4.0構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1RNA總量的提取及檢測 提取幼嫩莢果總RNA后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示28S rRNA、18S rRNA 條帶清晰，且前者亮度約為后者的2倍(圖1)，表明所提取RNA完整性較好；經(jīng)NANODROP 1000紫外分光光度計檢測，260/280、260/230分別為1.92、2.11，說明純度較高，所提取RNA可以用于后續(xù)試驗。

圖1 箭筈豌豆莢果總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2RT-PCR 擴增 以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈作為模板，用引物P1和P2擴增GAPDH基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)約在1 141 bp附近有一亮帶，且上下無雜帶，與目的產(chǎn)物大小相近(圖2)。推測此條帶可能是GAPDH基因片段，結(jié)果有待進一步鑒定。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3陽性克隆的鑒定 將目的片段切膠回收，連接至pGM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選隨機挑取10個陽性克隆提取質(zhì)粒，選取3個樣本提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，目的產(chǎn)物大小約為1 141 bp，與RT-PCR結(jié)果一致(圖3)。將樣本送往上海生工測序。

圖3 陽性克隆的PCR鑒定

2.4測序結(jié)果及序列分析 測序結(jié)果顯示，插入片段長度為1 141 bp、編碼381個氨基酸(圖4)。Blast比較結(jié)果顯示，該核酸片段與多種植物GAPDH的GapB亞基基因核酸序列相似度達83%，編碼氨基酸序列的相似度在95%以上，表明克隆獲得的片段為組成箭筈豌豆GAPDH的GapB亞基基因片段。

圖4 箭筈豌豆GAPDH基因片段的核苷酸序列及推測的氨基酸序列

將預(yù)測的箭筈豌豆GAPDH氨基酸序列與大豆(Glycinemax，ABA86963.1)，豌豆(Pisumsativum，ABA86964.1)，蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002500706.1)，煙草(Nicotianatabacum，P09044)，擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_174996.1)，菠菜(Spinaciaoleracea，P12860.1),玉米(Zeamays，CAA10352.1)，日本稻(Oryzasativasupsp.Japonica，ABF93788.1)和印度稻(O.sativasupsp.Indica，AAB8213301)的GAPDH氨基酸序列進行進化樹分析(圖5)及多重比較(圖6)，發(fā)現(xiàn)它的保守位點為353個，而非保守位點為28個，說明本研究克隆到的片段為箭筈豌豆GAPDH基因的高度保守區(qū)域。進一步的分析表明(圖6)，該片段與大豆GAPDH的相似度最高，達99%；與日本稻GAPDH的相似度最低，為93%；與擬南芥GAPDH相似度94%。故將克隆到的基因命名為VsGAPDH，并在GenBank注冊，登錄號HM117006。

圖5 VsGAPDH與其他植物GAPDH基因的氨基酸序列的進化樹分析

3 討論

構(gòu)成高等植物GAPDH的三類亞基(GapA，GapB和GapC)并非起源于共同祖先，GapA與GapB具有較高的序列相似度，GapC與GapA或B的氨基酸序列相似度僅為45%，暗示GapA與GapB具有較近的親緣關(guān)系[12]。本研究克隆獲得的基因片段與多種植物GapB基因序列高度相似，其中與大豆GapB基因相似度為99%，與擬南芥GapB基因相似度94%，表明這一片段為來自箭筈豌豆的GapB基因。

高等植物GapB基因在進化上較為保守，其氨基酸序列相似度在一定程度上反映不同物種親緣關(guān)系遠近[13]。分析表明，箭筈豌豆GapB與豆科其他物種相關(guān)基因相似度較高。目前，對箭筈豌豆的遺傳背景所知有限，同源克隆仍是獲得功能基因的首選技術(shù)。因此，借鑒近緣物種如大豆，豌豆上的現(xiàn)有研究成果將極大提高箭筈豌豆的功能基因克隆及研究的效率。

在高海拔地區(qū)引種馴化的箭筈豌豆品系與原種相比表現(xiàn)出抗旱能力增強，生育期縮短，種子產(chǎn)量增加等多種可能與能量代謝相關(guān)的性狀[14]。同工酶表達差異在一定程度上與這些性狀在品種間的差異相一致[15]。然而，進一步的育種工作需要對這些特性產(chǎn)生的分子機制進行深入分析。高等植物GAPDH基因參與了高等植物的碳固定，Calvin循環(huán)等能量代謝過程[1]，因而箭筈豌豆GAPDH基因的克隆將為相關(guān)工作的開展奠定基礎(chǔ)。

圖6 VsGAPDH氨基酸序列片段與其他植物GAPDH基因的氨基酸序列多重比較

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