高寒退化草地恢復中種子包衣對土壤微生物和植株生長的影響

劉迎春，劉志林，向畑恭男

(1.青海畜牧獸醫職業技術學院，青海 湟源 812009； 2.高知工科大學物質環境科學系，日本 高知 780-0000)

在高寒退化草地上建植栽培草地，土壤養分直接影響植物生長和栽培草地的建植。高寒草地土壤養分的特點是，有機質含量高，其含量高于4%的土壤占高寒地區的38%；速效養分含量低，速效氮低于93 mg/kg的土壤占高寒地區的54%，速效磷含量低于6 mg/kg的土壤占高寒地區的96%[1]。在高寒氣候條件下，土壤微生物的種類和數量較少，而且全年只有近2個月生長較活躍期[2-4]。隨著退化草地營養物質量減少，土壤微生物種類和數量更是大大降低[5]。高寒退化草地上建植栽培草地的經驗表明，建植的第2-3年，草地生產力持續上升，但自第4年起出現大幅度的下降[6-7]。其原因之一是施化肥不能改良土壤環境使牧草持久增產。所以調控土壤微生物的活性，是改良高寒草地土壤性能、持續提供養分、確保草地持續生產力的關鍵。

植物根系與土壤微生物之間關系密切，根系分泌物和微生物殘體，都為土壤增添有機質，微生物分解有機質為植物生長提供速效養分。提高根際微環境中的微生物的生長和活性，可以促進植物和微生物的生長，同時促進土壤環境可循環的良性發展。退化土地改良中，施用固氮菌和溶磷菌[8]或EM菌肥[9]可改良土壤微生物和根際養分。禾本科作物根際施固氮菌[10]或酵母菌[11]，種子產量提高60%～91%。梁寧[12]發現，在貧瘠的土壤表層噴灑脫鹽單細胞海洋微藻懸浮液后，土壤各層的微生物活性均提高。用廢紙漿、脫鹽單細胞海洋微藻粉沫和土壤微生物混合物將林木種子包裹成顆粒，將顆粒置于木樁孔眼中，把木樁打入貧瘠的土壤表層，林木種子的發芽率和樹苗的生長都顯著改善[13]。

本研究利用植物性吸水材料和微藻粉包衣種子，并接種微生物孢子，分析包衣材料和微藻體是否可以為微生物提供生長必需的養分，使土壤微生物的活性提高，從而促進植物生長；以及包衣材料對土壤微生物活性的促進作用是否可以延續，以期通過種子包衣和接種微生物孢子來改善根際周圍的土壤肥力。

1 材料與方法

1.1牧草種 垂穗披堿草(Elymusnutans)和山野豌豆(Viciaamoena)，均由青海畜牧獸醫職業技術學院種子庫提供。

1.2種子包衣材料和包衣方法 包衣材料來源于植物的親水膠如黃原膠、羧甲基纖維素鈉和角叉膠，以及單細胞海洋微藻(Phaeocystissp.neconon-1)粉沫。單細胞海洋微藻采自日本沖繩島，在添加Eppley’s營養液的人工海水中培養。培養條件為光照1 600 lx、室溫、持續充氣，培養4周后，離心過濾收集，淡水沖洗脫鹽4遍，65℃烘干，研磨成粉末；藻體質量的50%是細胞外多糖包膜，具有很強的吸水性，藻粉的60%為有機物，37%為無機物[14]。為了觀察微藻對植株生長的影響，本研究采用兩種混合物包衣種子：1號混合物中含有微藻(簡稱：微藻+)，2號混合物中不含微藻(簡稱：微藻-)，混合物成分見表1。用兩種包衣混合物手工完成兩種牧草的種子包衣。

表1 兩種包衣混合物的成分 %

1.3微生物 本研究采用曲霉屬曲霉真菌(Aspergillusspp.)和鏈霉屬放線菌(Streptomycesspp.)。用廢紙漿和微藻混合物壓成2 mm厚的薄片，將濕薄片置于高寒草地土壤表面，每天澆水4～5次，用玻璃罩罩住濕潤的薄片。8 d后，薄片上著生了曲霉菌和鏈霉菌的菌落，分別將曲霉菌黑色的分生孢子和鏈霉菌白色的孢子從薄片上刮下來，接種在馬鈴薯(Solanumtuberosum)瓊脂培養基上，25℃下培養14 d后，再將曲霉菌分生孢子和鏈霉菌孢子分別接種在新馬鈴薯瓊脂培養基上，反復分離3次。最后用含有0.01% Triton X-100的0.85% 的鹽水，將培養基上黑色和白色的孢子分別沖洗下來，高速離心濃縮孢子懸浮液， -20℃下儲存。兩種孢子的懸浮液按1∶1的比例混合，孢子濃度為1.7×106孢子/mL(簡稱為×1孢子)，稀釋10倍后孢子濃度為1.7×105孢子/mL(簡稱為×0.1孢子)，無孢子懸浮液(簡稱為×0孢子)。-20℃儲存的孢子解凍后，在包衣材料制成的培養基上的萌發率為96%～98%(未顯示試驗數據)。為了考察微生物孢子的作用，按3個劑量接種孢子：×1、×0.1和×0孢子(對照)，將包衣種子在3種孢子劑量的懸浮液中浸泡1 min后馬上播種。

1.4土壤呼吸量的測定 土壤取自海拔3 000 m的高寒草地。通過土壤呼吸量的測定確定土壤微生物活性。測定方法如下：兩個體積相同的密閉玻璃瓶，用內徑為3 mm塑料管連接，塑料管上連接一個電子微壓傳感器(KYOWA,PDV-10GA)，傳感器的輸出端連接一個記錄器。兩個玻璃瓶底部都盛有10 mL 4 mol/L的KOH。將盛有5 g土樣的小玻璃碗分別放入兩個玻璃瓶中，其中給一個玻璃瓶的土樣中注入700 mg/mL的葡萄糖溶液5 mL，另一個玻璃瓶的土樣注入蒸餾水，4～5 min后，連接的電子微壓傳感器的記錄器上開始顯示壓力差，因為土壤微生物分解葡萄糖過程中產生的CO2，被瓶底部的KOH吸收生成K2CO3，因而壓力降低，兩邊玻璃瓶的壓力出現壓力差，顯示在記錄器上。將高寒草地土壤在120℃下高壓滅菌40 min，再與不同比例的高寒草地土壤混合，用這套測量儀測定各種土壤樣品的壓差，確定測量儀的靈敏度、穩定性和土壤微生物活性的線性關系。可用土壤微生物呼吸產生的CO2(mL/min)表示微生物的呼吸量。

1.5微藻和孢子對牧草生長的影響(試驗1) 于2009年5月6日-7月24日在青海省湟源縣青海畜牧獸醫職業技術學院試驗地進行，海拔2 665 m， 36°41′ N，101°15′ E。將100粒包衣并接種微生物孢子的兩種種子播種在花盆(直徑×高=19.5 cm×20.0 cm)土壤中，不覆土，花盆置于室外屋檐下，以便于控制植物生長過程中的水分。試驗期的溫度為9～27℃，平均日照時數7.2 h/d。每2 d每花盆澆水300 mL，通過稱量烘干(12 h)土壤，測得土壤水分含量為15%～18%，這是模擬高寒草地土壤水分條件[15]。每天早晨觀察種子出苗情況，當胚芽鞘的長度為1 mm 時視為種子出苗。每盆中保留10個最早出苗的植株，生長80 d后，挖出植株, 數山野豌豆的根瘤數，60℃烘干2 h，稱植株干質量。植株從花盆中收獲后，立即測定土壤的呼吸量。試驗重復3次。

1.6微藻和孢子對牧草生長和土壤微生物的持續作用(試驗2) 試驗1花盆中的牧草生長80 d收獲后(第1茬)，土壤仍留在原花盆中，播撒未包衣、未接種微生物孢子的兩種牧草種子。本試驗包括4個處理，處理1、2、3分別為微藻粉+包衣,并接種3個不同劑量孢子(×1、×0.1、×0)的第1茬牧草的花盆；處理4為未包衣、未接種孢子的第1茬牧草的花盆；用新土花盆為對照。試驗于2009年7月25日-9月26日在青海畜牧獸醫職業技術學院試驗地進行。試驗期內的溫度5～32℃，平均日照時數6.6 h/d，每2 d每花盆澆水300 mL，10個最早出苗的植株留在花盆中，生長60 d后，挖出植株，數山野豌豆的根瘤數，60℃烘干2 h，稱量植株干質量。植株從花盆中收獲后(第2茬)，立即測定土壤的呼吸量。試驗重復3次。

1.7數據處理和統計分析 用SAS 8.0進行統計分析。用兩因素和單因素方差分析法，分析出苗率、植株干質量、根瘤數和土壤呼吸量。種子出苗率數據經過反正弦轉換后，用于方差分析。

2 結果與討論

2.1包衣混合物中的微藻和微生物孢子對牧草生長的影響 包衣種子的出苗率均極顯著地高于未包衣種子(P<0.01)，不同包衣混合物和接種孢子劑量，也導致了出苗率的極顯著差異(P<0.01)(表2)。當包衣混合物中含有藻粉、孢子劑量為×1時，植株的干物質量達到最高值，垂穗披堿草植株為184 mg/株，山野豌豆為156 mg/株(P<0.01)；山野豌豆的根瘤數達到最高值(P<0.01),為25個/株，方差分析表明包衣混合物中的微藻與孢子兩個因素之間存在互作關系。說明微藻和孢子對兩種牧草生長的促進作用缺一不可，可能微藻粉和孢子的互相作用，提高了土壤微生物的活性。另外,不論哪種植物，當混合物含有微藻粉并接種孢子時(微藻+、×1孢子和微藻+、×0.1孢子)，土壤的呼吸量極顯著地高于其他處理(P<0.01)，而且植株的干物質量與土壤呼吸量之間存在著極顯著的正相關關系(垂穗披堿草：R2=0.987，P<0.001；山野豌豆：R2=0.942，P<0.001)，山野豌豆的根瘤數與土壤呼吸量之間也存在著極顯著的正相關關系(R2=0.892,P<0.001)。證明植株生長量的增加是土壤微生物活性提高所致，包衣混合物中微藻粉和微生物孢子的相互作用直接或間接地提高了植株生長量。

表2 種子包衣、微藻和微生物對兩種牧草種子出苗率、植株干質量、根瘤數和土壤呼吸量的影響

本試驗采用土壤曲霉真菌和放線菌。高寒草地土壤真菌的生物量最大，其次是放線菌[16]，因此采用的曲霉真菌和放線菌引發了土壤微生物活性和植株生長的提高。玉米(Zeamays)植株的根際土壤中分離出固氮和溶磷的細菌，試驗室擴繁后，再將這些細菌回歸根際土壤，玉米籽粒產量顯著提高[17]。在石灰礦區植被恢復中，將土壤中分離出的真菌在試驗室進行擴大繁殖，再將該真菌接種于種子上，植株生長量顯著高于對照[18]。園藝植物培養液中添加固氮菌，促進了植物生長[19]。植物根際的土壤微生物被分離出來，經過繁殖擴增再回歸土壤環境。而在本研究中，不僅分離并異地繁殖擴增了土壤微生物，而且以種子包衣作為載體，將土壤微生物大量地回歸植物根際，人為地加入了植物性親水膠和藻粉，為微生物的生長繁殖提供碳、氮、磷和鉀的營養，進而改善了根際營養條件。包衣材料中的微藻和微生物導致土壤微生物的活性提高和植株的生長。

包衣種子出苗率全部高于未包衣種子，說明種子包衣僅促進了種子的早期萌發，提高出苗率，而后期植株生長則有賴于包衣混合物中的藻粉與微生物之間的相互作用。

2.2包衣混合物的微藻和孢子對植物生長和土壤微生物活性的持續作用 第1茬種子處理效應均表現在第2茬植物的干質量和根瘤數上，如果第1茬包衣種子含有微藻和微生物孢子時(微藻+、孢子×1或0.1)，第2茬植物植株的干質量極顯著地增加(P<0.01)，山野豌豆的根瘤數也極顯著地增加(P<0.01)(表3)。兩種植物，第1茬包衣種子含有微藻時，收獲第2茬后土壤呼吸量均顯著提高(P<0.05)。同樣，第2茬植株的干物質量與土壤呼吸量之間也存在著顯著的正相關的關系(垂穗披堿草為R2=0.719，P<0.001；山野豌豆為R2=0.982 ，P<0.001)，山野豌豆的根瘤數與土壤呼吸量之間也有極顯著的正相關(R2=0.989,P<0.001)。證明第1茬植株收獲后，因為某些物質如土壤微生物等留在了土壤中，包衣混合物的微藻和孢子引發了土壤微生物的大量繁殖，改變了根際環境，這種效應持續到后續的植株生長過程中。另外，植物根系分泌物可以活化礦物質養分、促進植物吸收土壤養分；細胞和組織的脫落物等，又是土壤微生物的能源物質，通過影響土壤微生物的數量和活性，對土壤中的養分元素起到了間接的活化作用[20]。這種良性循環使得土壤環境得以改善。

表3 微藻粉和微生物對兩種牧草植株干質量、根瘤數和土壤呼吸量的持續影響

種子微藻包衣并接種微生物孢子，提高了植株根際土壤微生物活性和植物生長，并且誘導了土壤環境和植物生長的持續改善和提高。植株根際藻和微生物相互作用的機理、以及對植株生長影響的機理還有待于進一步的研究。

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