小花堿茅HKT1;4基因片段的克隆與序列分析

李 劍,趙常玉,吳永娜,包愛科，馬 清,郭 強,王鎖民,張金林

(蘭州大學草地農業科技學院 農業部草地農業生態系統學重點開放實驗室,甘肅 蘭州 730020)

大多數農作物不能在高鹽環境下生長，灌溉地鹽漬化對農業生產力造成了嚴重威脅[1-2]。鹽漬化土壤中，Na+是一種毒害離子，它可以抑制K+的吸收，降低酶活性，影響植物新陳代謝，最終表現為植株生長緩慢甚至死亡[3-4]。K+是植物生長發育所必需的礦質元素之一，也是植物細胞中最豐富的一價陽離子，占植物干質量的2%～10%，它參與調節細胞膨壓、電荷平衡、氣孔開閉和酶活性等許多重要的生理生化過程[5-6]。在鹽脅迫下，限制Na+吸收，增加Na+外排，同時提高對K+的選擇性吸收能力，維持細胞中高的K+/Na+是植物抗鹽性的關鍵[7]。大量研究發現，高親和性K+轉運蛋白(high-affinity K+transporter，HKT)在高等植物拒Na+和選擇性吸收K+過程中發揮著重要作用[8-9]。Schachtman和Schroeder[10]首次從小麥(Triticumaestivum)幼根中克隆到TaHKT2;1，隨后相繼在其他植物中也發現了HKT類蛋白。根據異源表達差異，Platten等[11]將HKT類蛋白分為兩類：第1類以擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1為代表，主要轉運Na+，在Na+回收中發揮作用，包括水稻(Oryzasativa)OsHKT1;5、一粒小麥(T.monococcum)TmHKT1;4-A2、TmHKT1;5-A1和小麥TaHKT1;5-D1；第2類以小麥TaHKT2;1為代表，為K+和Na+的共轉運體，在K+、Na+選擇性吸收中發揮重要作用，包括水稻OsHKT2;1和OsHKT2;2等。

小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)廣泛分布于我國東北和西北地區，是禾本科堿茅屬多年生優質牧草，耐鹽堿[12-13]。近年來，小花堿茅極強的抗鹽堿性引起人們的廣泛關注。閻秀峰等[14]通過洗葉技術，認為小花堿茅的耐鹽機制是其具有泌鹽能力。韋存虛等[15]采用掃描電鏡和X射線電子探針研究發現蠟質層泌鹽可能是其正常功能。但解剖學和葉表面觀察都沒有發現鹽腺或泌鹽結構[16-18]。研究表明，小花堿茅根部對K+/Na+選擇吸收能力很強，約是小麥的2倍[19]；最新研究表明，葉片泌鹽并不是小花堿茅耐鹽的主要機制；限制Na+單向內流速率，減少體內Na+凈積累，維持高的K+/Na+則是小花堿茅抗鹽的關鍵[20]。本研究在已經克隆小花堿茅Actin[12]和AKT1[13]的基礎上，進一步克隆其HKT1;4基因片段，旨為進一步探明小花堿茅拒Na+的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 小花堿茅種子2010年采自甘肅省張掖市臨澤縣白寨村。EscherichiacoliDH5a菌株由農業部草地農業生態系統學重點開放實驗室保存。

1.2主要試劑 植物總RNA提取試劑盒(生工生物工程上海有限公司生產)，反轉錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司生產)，PCR擴增試劑盒、PCR產物回收試劑盒、pMD19-T Simple載體(寶生物工程大連有限公司生產)，DNA ladder(天根生化科技北京有限公司生產)，其他生化試劑均為進口或國產分析純。

1.3試驗方法

1.3.1總RNA的提取 從小花堿茅幼根(K+饑餓處理24 h)中提取總RNA，方法參考總RNA提取試劑盒說明書。

1.3.2引物的設計與合成 通過對高粱(Sorghumbicolor)、水稻和一粒小麥等幾種植物HKT1;4基因的氨基酸序列進行同源性比對，找出高度保守的片段，對應于核苷酸片段，根據引物設計原則，利用DNAMAN和Primer Premier 5.0生物軟件設計一對簡并引物PF和PR，推測目的片段長度為635 bp。引物由上海生工合成。PF：5′-TCGYCTACTTCSTCRCCRTCTCCT-3′，PR：5′-CATGWACCCGCAGYTSGAGAACGT-3′，其中，Y=C/T，S=C/G，R=A/G，W=A/T。

1.3.3RT-PCR擴增 反轉錄過程按照試劑盒操作說明進行。PCR反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL、10 μmol/L PF 1 μL、PR 1 μL，Taq DNA polymerase(5 U/μL) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加無菌水至總體積50 μL。反應程序：94 ℃熱啟動2 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，30個循環；最后72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，按照膠回收試劑盒說明書回收和純化目的片段，保存于-20 ℃備用。

1.3.4陽性克隆的篩選與鑒定 將回收目的片段與pMD19-T Simple載體按照物質的量10∶1混合，于16 ℃連接2 h。連接產物全部加入到100 μL感受態大腸桿菌細胞中，冰浴30 min；42 ℃熱激90 s；冰浴1 min。加入800 μL無氨芐青霉素的液體LB培養基，搖菌1 h(37 ℃，180 r/min)。將菌液加入含有氨芐、x-gal和IPTG的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養。次日，挑選白色單菌落，經PCR檢測后送生工生物工程上海有限公司測序。

1.3.5序列的生物信息學分析 BLAST在NCBI網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行；序列的翻譯和分析比較通過DNAMAN和Primer Premier 5.0生物軟件進行。

2 結果

2.1總RNA的提取與檢測 以小花堿茅幼根為材料提取總RNA，甲醛變性膠電泳和NANODROP1000核酸蛋白檢測儀檢測表明，提取的總RNA完全滿足下一步試驗需要。

2.2RT-PCR擴增 以總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用簡并引物PF和PR進行PCR擴增。PCR產物經凝膠電泳檢測后發現在比600 bp略高處有一條帶，且上下無雜帶，與預測的目的片段大小基本一致(圖1)，推測可能是HKT1;4基因片段，有待進一步檢測。

圖1 PCR產物凝膠電泳圖

2.3陽性克隆的鑒定 將目的片段連接到pMD19-T Simple載體上，轉化E.coliDH5a。從LB培養基平板上隨機挑選5個白色單菌落，分別搖菌后提取質粒，進行PCR檢測，得到的擴增片段大小與所克隆片段一致(圖2)，表明這些為陽性克隆，可以進行測序。

圖2 陽性克隆的PCR檢測

2.4測序結果與序列分析 陽性克隆測序結果表明，本試驗得到一段長629 bp的HKT1;4序列片段，與GenBank中注冊的高等植物HKT1;4基因核苷酸序列同源性在74%以上；編碼209個氨基酸(圖3)，將此氨基酸片段與其他植物HKT1;4蛋白氨基酸進行同源性比對后發現，與一粒小麥TmHKT1;4-A2、TmHKT1;4-A1、高粱(Sorghumvulgare)SbHKT1;4和水稻OsHKT1;4的同源性分別為73%、70%、67%和61%，從而確定本試驗克隆的片段為小花堿茅HKT1;4基因，并命名為PutHKT1;4(圖4)。采用在線TMpred Server軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) 對小花堿茅PutHKT1;4氨基酸序列進行跨膜區預測發現可能存在5個跨膜區，序列位置分別為1-17，32-51，61-82，154-171，193-209(圖3、圖5)。多重比對后發現，小花堿茅PutHKT1;4氨基酸序列上存在編碼P-loop A區域的一段保守序列IDLFFTAVSSMS，箭頭所指的S為P-loop A區域的特異性絲氨酸離子選擇性位點(圖6)。

圖3 小花堿茅PutHKT1;4基因片段核苷酸及推測的氨基酸序列

圖4 PutHKT1;4與其他植物HKT1;4氨基酸序列的系統進化樹

圖5 PutHKT1;4氨基酸片段的跨膜區預測

3 討論與結論

土壤中過多的Na+對植物是有害的，尤其是對鹽比較敏感的農作物。研究Na+在植物體內的再循環途徑，對于提高植物抗鹽性意義重大。水稻OsHKT1;5的作用是從木質部中回收Na+，參與Na+在植物體中的再循環，從而減少Na+在植株地上部的積累[8]。 James等[21]從硬粒小麥(T.turgidum)耐鹽品系149中分離到兩個排Na+的主效基因Nax1和Nax2，擁有任意一個基因的品系植株比其他品系有更低的從根部向地上部轉運Na+的比率，同時增加吸收K+的比率。Nax1位點能夠從葉鞘和根木質部卸載Na+，防止Na+在地上部的過多積累，而Nax2位點只能在根部發揮作用。后來研究表明，一粒小麥TmHKT1;4-A2可能是Nax1的候選基因，TmHKT1;5-A1可能是Nax2的候選基因[22-23]。本研究所克隆的PutHKT1;4基因和一粒小麥TmHKT1;4基因一樣，屬于HKT家族的第1類。通常第1類HKT在第1個P-loop區域都有一個絲氨酸離子選擇性位點，第2類為甘氨酸離子選擇性位點(個別除外，如水稻OsHKT2;1)，這些位點可能與K+、Na+選擇性吸收相關[11]，本試驗克隆到的小花堿茅PutHKT1;4也有一段12個氨基酸的保守P-loop區域，且有絲氨酸位點。小花堿茅蘊藏著豐富的抗鹽基因資源，PutHKT1;4基因片度的克隆將為進一步研究小花堿茅耐鹽的分子機制奠定了基礎。

圖6 PutHKT1;4氨基酸序列與其他植物HKT1;4氨基酸序列多重比對圖

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