植物組織培養及其在草類植物中的研究和應用

趙麗君，王雪芳，張金林，王鎖民

(蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

植物組織培養(plant tissue culture)起源于20世紀初，從20世紀至今經歷了3個階段：萌芽階段(20世紀初-20年代末)、奠定階段(30年代初-50年代中)和蓬勃發展階段(50年代末至今)。1902年，德國植物學家Haberlandt[1]提出“植物細胞具有全能性”的理論，并將從虎眼萬年青屬(Ornithogalum)植物表皮細胞及Lamiumpurpureum和鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)葉肉柵欄組織中分離出的單個細胞置于含有蔗糖的Knop溶液中培養，這是植物組織培養的開端；20世紀30年代，White等[2]培養離體番茄(Lycopersiconesculentum)根尖，建立了可以繼代培養的第一個無性繁殖系，確立了植物組織培養的基本方法，40年代開始將植物激素應用于植物組織培養中，使得植物組織培養得到了長足的發展[3]；英國學者Steward和Mapes[4]將胡蘿卜(Daucuscarota)髓細胞培養成一個完整的植株，這是植物組織培養的第一個突破，60年代開始，植物組織培養迅速發展，并開始應用于生產實際中。目前，植物組織培養技術已滲透到植物生理學、病理學、遺傳學、育種學、藥學以及生物化學等研究領域，成為生物學科中的重要研究技術和手段之一，推動了相關學科的迅速發展。特別是植物組織培養技術與分子生物學及RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術緊密結合，成為細胞生物學和細胞遺傳學研究的基礎。植物組織培養技術還被廣泛應用于農業、林業、工業、醫藥業等多種行業，從而在生產實踐方面產生了巨大的經濟效益和社會效益。植物組織培養技術在草類植物中的研究和應用雖然起步較晚，但近年來發展非常迅速，已被廣泛應用于草類植物優良營養系的快速繁育[5-11]、遺傳轉化[12-27]、細胞和分子育種[28-31]以及次生代謝產物生產[32-34]等諸多方面。本研究對影響植物組織培養的因素、存在的主要問題及其解決方法進行探討，并重點闡述組織培養在草類植物中的研究和應用。

1 影響植物組織培養的因素

影響植物組織培養的內外因素很多，歸納起來主要有：外植體基因型、外植體的種類、培養基、植物生長調節劑的種類及濃度配比以及培養條件等。

1.1外植體基因型 外植體是指植物組織培養中作為離體培養材料的器官或者組織的片段，外植體材料的遺傳背景對植物組織培養的影響很大，不同植物或相同植物不同品種間存在著顯著的差異，基因型細微的差異都會造成材料的內源激素含量不同，引起不同品種間相同外植體的分化頻率和分化速度間差異的產生[35]。外植體的基因型影響植物的再生能力，劉建平等[36]就冬小麥(Triticumaestivum)不同基因型對花藥愈傷組織誘導率作了相關研究，發現不同基因型在同一培養環境條件下愈傷組織誘導率有明顯差異。何道一等[37]也比較了不同基因型蘋果(Maluspumila)的離體再生特點，結果表明,不同基因型蘋果葉片再生頻率的高低和再生類型存在顯著差異。何勇等[38]用6個高羊茅(Festucaelata)品種成熟種子為外植體進行了愈傷組織誘導，發現不同品種在相同培養條件下，愈傷組織誘導差異十分顯著，而分化再生能力無明顯差異。

1.2外植體的種類 外植體可以取自于植物的各種器官、組織或細胞等。外植體的種類、本身的生理生化特性對愈傷組織和不定芽的誘導起著決定作用。不同種類的外植體誘導愈傷組織和不定芽的能力大不相同；即使是同一植株，若生長在不同的環境條件(光照強度、光照時間、濕度、溫度和營養物質等)下，生理生化特征也會不盡相同；不同部位的外植體在組織培養時對培養基和培養條件的要求會不同，愈傷組織與不定芽的誘導能力也存在差異。這些差異可能是外植體本身含有的內源細胞分裂素與生長素的絕對含量和相對比例不同所造成的[39]，在植物組織培養過程中選擇合適的外植體至關重要。有研究表明，紅掌(Anthuriumandraeanum)不同部位的外植體(葉柄、莖段、葉)誘導愈傷組織的能力差異顯著。在最佳誘導培養基上，葉柄誘導率最高，達到86.7%，莖段次之，葉的誘導能力最差，但是葉最早誘導出愈傷組織[40]。王強龍等[41]以紫花苜蓿(Medicagosativa)的下胚軸、子葉、葉片和葉柄為外植體進行愈傷組織誘導和植株再生，結果表明，葉片胚性愈傷形成率最低，葉柄和子葉比較接近，而下胚軸的胚性愈傷形成率最高，即下胚軸為最佳外植體。陳季琴等[42]對多年生黑麥草(Loliumperenne)的3個品種選取成熟種子、成熟胚、胚軸和胚根4種外植體進行愈傷組織的誘導，分別得出適應不同外植體的激素配比。

1.3培養基 培養基是維持植物組織活力和提供其生長的人工配制的營養物質，在植物組織培養過程中，外植體的生長、分化需要的各種營養成分都是從培養基中獲得的，因此，培養基中營養物質的成分和比例對愈傷組織的誘導和植株再生起著決定性的作用。選擇合適的培養基是植物組織培養成功的關鍵，培養基的選擇主要考慮兩個方面：基本培養基的種類和各種激素的濃度及比例。植物組織培養中常用的基本培養基有MS和B5兩種，MS適合于大多數的雙子葉植物，而B5培養基常用于單子葉植物的組織培養。組織培養過程中，要根據植物的種類和外植體的類型選擇合適的培養基，這樣才能得到較好的誘導和再生效果。馮波[43]分別在基本培養基MS和B5上對霸王(Zygophyllumxanthoxylum)子葉、莖和莖節進行愈傷組織誘導，結果表明，MS更適合作為霸王組織培養的基本培養基。誘導蒜(Alliumsativum)的不定芽生根時，1/2 B5培養基的效果最好[44]。

1.4植物生長調節劑的種類及濃度配比 植物生長調節劑在組織培養的過程中有著重要的作用。植物內源激素是影響組織培養過程中形態發生變化的內在因素，不同基因型的外植體間內源激素的差異對愈傷組織和芽的誘導有重要的影響，植物生長調節劑則是通過調整植物內源激素的水平而起作用。生長調節劑的種類和濃度配比都會對植物組織培養造成影響。有研究表明[45]，在培養基中加入2,4-D時，黑麥草成熟種子20 d后出現淡黃色的愈傷組織，無2,4-D的培養基不能誘導產生胚性愈傷組織；當2,4-D質量濃度為0～5 mg/L時，隨著2,4-D質量濃度增加，黑麥草愈傷組織的誘導率逐漸增加。楊茹等[46]的研究表明，黑麥草成熟種子添加2,4-D的愈傷組織誘導率顯著高于添加NAA的，且2,4-D質量濃度為7 mg/L時誘導率最高，愈傷組織的質量也最好。在含有2,4-D 的培養基中加入少量的6-BA (0.1 mg/L)能進一步促進愈傷組織的誘導，隨著6-BA質量濃度的升高，愈傷組織的誘導率反而下降，濃度越高抑制作用越顯著。胡張華等[47]在N6+9 mg/L 2,4-D上添加2.0 mg/L ABA，發現高羊茅成熟種子的愈傷組織誘導率明顯提高，且能有效抑制胚芽和根的形成。

1.5培養條件 植物組織培養的培養條件主要包括光照強度和時間、溫度及相對濕度。由于植物材料培養在含糖的培養基中，光照的主要作用是誘導植物組織的形態建成，光照強度影響著離體培養細胞的增殖和器官的分化，對外植體細胞最初分裂的影響更為顯著。在以桃葉衛矛(Euonymusbungeanus)的硬枝為外植體誘導叢生芽的培養中，當光照強度為18 μmol/(m2·s)時，未能誘導出叢生芽并且硬枝逐漸變黃死亡；光照強度為36 μmol/(m2·s)時，才能誘導出叢生芽[48]。光照時間也會影響愈傷組織和芽的誘導，在培養甘薯(Ipomoeabatatas)莖尖分生組織時，光照時間14 h/d要優于10 h/d[49]。溫度對愈傷組織的誘導和生長有著決定作用，有研究表明[50]，溫度對草珊瑚(Sarcandraglabra)愈傷組織的誘導和生長影響顯著，溫度在23～28 ℃時，愈傷組織誘導率高且生長快，當溫度在15 ℃左右或32 ℃以上時，愈傷組織的生長受到嚴重抑制，逐漸死亡。同時變溫也傷害草珊瑚的愈傷組織，影響其生長。相對濕度是影響試管苗或其他離體器官在培養容器內水分狀況的重要環境因素之一[51]。尹品訓等[52]研究表明，激素水平、溫度、光照都不是大麻(Cannabissativa)玻璃化苗產生的主要影響因素，而濕度則是其產生的關鍵因素。

1.6其他因素 提供外植體植株的年齡也是影響愈傷組織誘導和分化的一個重要因素，有研究表明[53]，以低齡的幼苗下胚軸作外植體時，甘藍型油菜(Brassicanapus)芽的分化率最高，生長5 d的甘藍型油菜下胚軸再生頻率為35.0%，而當苗齡為9 d時，再生頻率只有20.2%。趙軍良等[54]研究發現，3～4 d的白菜(B.pekinensis)無菌苗的子葉分化率顯著高于其他苗齡。植物的組織培養過程中常常會產生大量的乙烯(C2H4)，外植體在培養過程中生長素的運輸會因為乙烯的存在而受到抑制，這導致器官和體細胞胚的發生受到影響。通常誘導愈傷組織和不定芽時，在培養基中加入乙烯抑制劑(如硝酸銀、氯化鈷、AVG、水楊酸等)，不定根的誘導會顯著地受到抑制，同時愈傷組織能快速形成，加快器官和體細胞胚的發生，外植體產生不定芽的數目也會增加，更為重要的是能促進某些很難再生的物種產生不定芽，從而提高再生頻率[55]。很多研究都表明，AgNO3對大白菜、油菜等植物的組織培養與植株再生有不同程度的促進作用[56]。AgNO3對愈傷組織和不定芽誘導的促進作用不是因為能夠抑制乙烯的合成，而是阻止了乙烯對多胺合成的干擾，多胺的合成則可以促進外植體體細胞胚的發生和不定芽的分化。另外AgNO3也會抑制乙烯的積累，降低培養容器中乙烯的濃度，從而促進不定芽的分化。在植物組織培養過程中培養基多為固體培養基，需要加入固化劑。一般使用瓊脂，瓊脂品質的好壞也會影響愈傷組織與芽的誘導分化。為了達到較好的離體培養效果，應該選擇雜質少、純度高、凝膠透亮、凝固快的瓊脂。

2 植物組織培養中存在的主要問題及解決方法

在植物組織培養的過程中，常常會存在褐化、污染和玻璃化等現象，這些問題嚴重影響組織培養的效果，應盡量避免其發生。

2.1褐化及控制措施 褐化，也稱酚污染，是指外植體在組織培養過程中，自身組織中酚類化合物與空氣接觸發生氧化反應產生棕褐色的酮類物質，使外植體變褐并逐漸死亡的現象。褐化中產生的有毒物質不僅使外植體和培養基變色，而且抑制很多酶的活性，嚴重影響外植體愈傷組織的誘導和脫分化，甚至會造成其死亡。褐化現象的發生與否是由外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性決定的。因此，影響褐化的因素主要為外植體材料和酶促因子[57]。有研究表明，抗氧化劑聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及抗壞血酸(Vc)濃度為200 mg/L時，可延遲野牛草(Buchloedactyloides)成熟胚愈傷組織的褐化；縮短繼代周期至5 d可有效防止愈傷組織褐化；外源多胺能影響內源多胺與乙烯的合成，并可減輕愈傷組織的褐化，改善其質量[58]。無花果(Ficuscarica)組織培養中，剛長出幼葉的頂芽與未發芽的頂芽相比，褐化現象較嚴重，分化率也較低[59]。王文靜等[60]在鳶尾(Iristectorum)組織培養的培養基中加入0.1% Vc或0.3%活性炭能明顯防止褐化。劉聞川等[61]探討了黑暗和1 000、2 000、3 000 lx的不同光照條件對槲蕨(Drynariaroosii)組織培養外植體褐化的影響，結果表明，在1 000 lx光照處理下槲蕨外植體的總酚含量積累較少。

在組織培養中可采用以下方法來避免或減輕褐化：1)培養基中加入抗氧化劑(如Vc、檸檬酸、二硫蘇糖醇等)或在抗氧化液中對外植體進行切割、剝離等處理。2)經常繼代可以防止酮類物質在培養基中的積累，減輕其對外植體的傷害，降低褐化發生的概率。3)培養基中加入1%的活性炭，由于其吸附作用可以除去酚類氧化產物，減少有毒物質對外植體的毒害；活性炭還可以減少光照強度，進一步降低褐化發生的可能；但活性炭也會吸附培養基中的營養物質和外源激素，所以含量不能過多。4)光照可以誘導植物組織內有些酚類氧化酶的活性，因此，組織培養的最初階段在黑暗條件下進行會減少褐化的發生。

2.2污染及解決措施 植物組織培養的過程較長，培養基中營養物質充足，光照、溫度、濕度和pH值等培養條件也適合大多數微生物的生長，并且微生物生長迅速、繁殖周期短，所以組織培養中任何一步帶菌都會污染整個體系。一般造成污染的原因有兩種：1)外植體本身寄生了很多微生物；2)實驗環境和操作過程中病原侵入到培養基中而造成污染。引起污染的微生物主要有細菌、霉菌和酵母菌三類，后兩類生長較快、造成的污染很容易發現并及時處理；但是細菌在培養基中有潛伏期，造成的污染一般不容易覺察，因此，細菌造成的污染在植物組織培養中是最嚴重的。污染不僅影響外植體的正常生長，更破壞了組織培養的正常進行，造成時間和資源的浪費。因此，在植物組織培養過程中，應該嚴格控制污染：對外植體進行嚴格的消毒，一般在75%的酒精、5%的次氯酸鈉或1%的HgCl2溶液中漂洗，在不損害外植體生長活力的情況下將其自帶的病原降到最少[62]；保持操作環境的清潔，操作中應穿戴橡膠手套、口罩、帽子，減少甚至消除環境和操作過程中的污染。

2.3玻璃化現象及其消除對策 玻璃化(vitrification)也稱過度水化現象，是指植物組織培養過程中外植體因生理失調或生理病變而呈半透明狀、外觀形態異常的現象。由于玻璃化苗的生理功能異常，難以移栽成活，玻璃化苗的出現對植物快速微繁殖是不利的。在木本及草本植物中已報道出現玻璃化苗的植物達70多種[63]。玻璃化苗的組織或植株呈半透明、水漬狀，脆弱易碎[64]；葉綠素和蛋白質含量顯著下降，分化能力降低，很難繼續增殖和生根[65]。目前，研究已證實玻璃化現象只是植株的一種表型特征，玻璃化的組織器官在一定條件下可恢復，并不會遺傳到后代[66]。

防止玻璃化的方法主要有：1)基本培養基選擇固體培養基，并適當提高培養基中瓊脂的濃度，降低培養基的襯質勢，阻止細胞過多的吸水，從而防止玻璃化現象的發生；2)增加培養基中蔗糖的含量，培養基的滲透勢也就會隨之降低，外植體不能從培養基中獲得過多的水分而發生玻璃化現象；3)降低培養基中細胞分裂素的濃度；4)嚴格控制溫度；5)把外植體置于自然光照下培養，可消除輕微的玻璃化現象；6)盡可能的增加培養容器的通風性，以降低相對濕度，改善氧氣供應狀況，可選用透氣性好的封口膜封口。張燕玲等[67]在滿天星(Gypsophilasp.)組織培養中，發現玻璃化苗的數量隨著培養基中糖分和瓊脂濃度的增加而減少，而且聚乙烯醇對滿天星玻璃化現象有明顯的抑制作用。趙佐敏[68]在非洲菊(Gerberajamesonii)組培苗玻璃化控制研究中表明，隨著6-BA濃度的降低，玻璃化苗比例呈遞減趨勢；隨著溫度的降低(從28 ℃降到18 ℃)，玻璃化苗逐漸消失；使用透氣性封口膜可抑制玻璃化苗的產生。

3 組織培養在草類植物中的研究和應用

植物組織培養技術在草類植物中的研究和應用起步相對較晚，但近年來發展迅速，已被廣泛應用于草類植物的快速繁育、遺傳轉化、細胞和分子育種以及次生代謝產物生產等諸多方面。

3.1無性系的快速繁殖 應用組織培養進行無性系的快速繁殖可追溯到20世紀60年代的“蘭花工業”[69]，直到現在已成為組織培養應用十分普遍的一個領域，成千上萬種植物通過離體繁殖得到無性系，并形成產業，帶來了巨大的經濟效益。草類植物的無性系繁殖主要利用了其繁殖速度快、繁殖量大、不受地區氣候影響、占用土地面積小等特點，可用于解決一些品種繁殖系數低、周期長的問題，特別對于名貴稀有草類的繁殖推廣具有重要意義(表1)。

3.1.1稀缺瀕危草類的快速繁殖 利用組織培養快速繁殖稀缺瀕危草類主要是對名貴中草藥的繁殖。近年來隨著對許多草類植物的化學成分及藥理方面的研究，許多草類植物的藥用價值逐漸被提出。如金鐵鎖(Psammosilenetunicoides)已作為稀有瀕危物種被列于《中國植物紅皮書》中，屬國家二級保護植物[70]。甘草(Glycyrrhizauralensis)作為醫藥中最常見的藥物，早在1984年就進行了試管無性繁殖研究工作[71]。香根草具有特殊的生物學特征和強大的根系，在水土保持方面起著重要的作用，主要靠分蘗繁殖，遠不能滿足實際需要，為提高香根草的繁殖速度，韓露等[5]對其愈傷組織誘導和快速繁殖進行了研究。麻花秦艽是常用的上品藏藥，徐文華和陳桂琛[6]以其莖尖為外植體進行了離體快速繁殖試驗。苦皮藤被國家審批為植源性殺蟲劑，其乳油、水乳劑、微乳劑已不斷投放市場并收到了巨大的經濟效益和社會效益。隨著人們對苦皮藤的大力開發利用, 自然資源已面臨短缺，為有效保護野生資源，馬艷等[7]對其組織培養進行了研究，為其快速繁殖和工業化生產提供了有效途徑。

3.1.2優良品系的無害化快速繁殖 在自然界中，許多草類植物的種子不易獲得或存在發芽率很低的問題，因此采用根系無性繁殖。但根系長期的無性繁殖易感染病毒，導致種群退化，產量下降，品質低劣。用南丹參優良株系的莖尖或幼葉進行組織培養快速繁殖，1株良種苗1年可繁殖上萬株試管苗，可迅速擴大優良種群[8]。溪黃草是民間常用草藥，用種子繁殖后代，性狀容易分離；扦插繁殖生根困難而且繁殖系數低，所以導致其很難推廣；利用組織培養技術進行無性繁殖既可以保持其優良種性，又可以短期內大量繁殖，使工廠化育苗成為可能[9]。黃芩不僅是一種草本藥用植物，國內還被作為盆景進行栽培，但利用種子和扦插繁殖容易感染病毒，導致品種退化；為滿足市場要求，培育優良種苗，李永紅等[10]進行了黃芩的組織培養與快速繁殖研究。

表1 組織培養在草類植物上應用的成功舉例

3.1.3轉基因植株的快速繁殖 隨著現代分子生物學的快速發展，運用傳統雜交育種和基因工程相結合培育草類新品種已成為育種的重要手段。目前，轉基因高羊茅、紫羊茅、黑麥草和早熟禾等禾本科草類植物和豆科牧草苜蓿、白三葉等已培育成功，但考慮到轉基因植株的遺傳穩定性，對轉基因植株的大量擴繁多采用無性繁殖的方法，例如，包愛科[11]對AVP1轉基因紫花苜蓿抗逆性檢測時，使用莖段扦插的方法進行快速擴繁；但轉基因草類植物如單子葉的禾本科草類，不能使用扦插的方法，利用組織培養技術可以加快其快速繁殖。

3.2草類植物遺傳轉化再生體系的建立 遺傳轉化系統是指將外源基因通過某種方法導入植物細胞或原生質體，利用細胞的全能性獲得轉基因植株，從而有目的地改變植物的某些性狀。所以，建立組織培養再生體系是遺傳轉化的前提，只有良好的再生體系才可以提高轉基因的效率。目前為止，對草類植物進行遺傳轉化的再生體系主要通過愈傷組織、懸浮細胞和原生質體培養建立的(表2)。

3.2.1愈傷組織為受體的遺傳轉化 在草類植物中，以愈傷組織為受體已建立了許多轉基因體系。金淑梅等[12]用根癌農桿菌介導法，以愈傷組織為受體，將目的基因Gus整合進苜蓿基因組中。劉萍等[13]以草坪型黑麥草愈傷組織為受體獲得轉基因株系Gsc_LP5。馬生健等[14]用高羊茅種胚離體誘導的胚性愈傷組織作受體進行了基因槍轟擊試驗，獲得了遺傳穩定的抗除草劑PPT的轉化植株。趙軍勝等[15]用高羊茅下胚軸來源的胚性愈傷組織進行了遺傳轉化。采用下胚軸為外植體，已成功地將擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtNHX1[16]和AVP1[17]基因轉化紫花苜蓿，獲得了耐鹽、耐旱和耐貧瘠性顯著提高的紫花苜蓿新品系。

3.2.2懸浮細胞為受體的遺傳轉化 最初利用組織培養進行的遺傳轉化，以懸浮細胞為受體比較常見。Wang等[18]以懸浮細胞系為受體，獲得了轉Hpt和Bar基因的高羊茅。Spangenberg等[19]用高羊茅胚性懸浮系為受體進行了遺傳轉化。Dalton等[20]通過基因槍轟擊懸浮細胞系，建立了黑麥草的轉基因體系；使用硅碳纖維介導了黑麥草、高羊茅、匍匐剪股潁的細胞懸浮系，獲得了抗潮霉素的轉基因植株[21]。Bettany等[22]用高羊茅和黑麥草胚性懸浮細胞為受體，使用農桿菌轉導法導入了外源基因Gus。胡張華等[23]用帶有質粒pDBA121(含Hpt基因和Bar基因)的農桿菌菌株EHA105轉化高羊茅胚性懸浮細胞，建立了可重復的、高效的農桿菌介導的高羊茅遺傳轉化系統。

表2 草類植物以組織培養為手段進行遺傳轉化的舉例

3.2.3原生質體為受體的遺傳轉化 由于從懸浮細胞培養獲得的植株在遺傳上存在不穩定的現象，同時也不便于進行轉基因工作[74]。Ha等[24]用電激法以高羊茅原生質體為受體進行了遺傳轉化。Wang等[25]以原生質體為受體，獲得了轉Hpt基因的黑麥草。Inokuma等[26]以原生質體為受體獲得了轉Gus和Hpt基因的日本結縷草。Chai等[27]以原生質體為受體成功的將Hpt基因導入匍匐剪股穎。

3.3花藥培養和單倍體育種 花藥組織培養主要是誘導形成單倍體植株，可以快速獲得純系，縮短育種時間。自Guha和Mahcshwari首次從曼陀羅(Daturastramonium)花藥誘導出花粉單倍體植株以來，世界各地均開展了花藥培養，我國于20世紀70年代獲得了第一批水稻(Oryzasativa)花藥培養的單倍體植株。目前利用花藥培養培育的新品種多見于農作物，如水稻、小麥、玉米(Zeamays)等。近年來，先后也出現了草類植物的花藥培養，如馬菊蘭[28]對4個苜蓿品種的花藥培養預處理方法和培養基進行了研究，從而建立了苜蓿花藥培養高效再生體系，大大提高了苜蓿育種的效率；耿小麗[29]以5個苜蓿品種為試材，利用花藥培養誘導了苜蓿單倍體植株；段承俐等[30]開展了三七的花藥培養，吳中心等[31]利用花藥培養系統選育了煙草抗赤星病品系(表1)。

3.4植物體細胞誘變和突變體篩選 植物體細胞在離體培養條件下本身容易發生染色體畸變和基因突變，如果采用改變外界條件進行誘變，則誘變的幾率更高。這為培育新品種奠定了良好的基礎。周榮仁等[75]用組織培養及逐步增加NaCl濃度的方法篩選出能耐2% NaCl的煙草愈傷組織，但在2% NaCl培養基中繼代29次后，再移入無鹽培養基中培養11和20代后，耐鹽性退化到只耐1.5%與1.0% NaCl的水平，不能保持提高了的耐鹽性。李紅等[74]以紫花苜蓿莖段為材料進行愈傷組織誘導，采用紫外線和NaN3化學誘變處理其愈傷組織，提高了紫花苜蓿的抗堿性。李波等[75]對紫花苜蓿莖段誘導的愈傷組織進行不同濃度的硫酸二乙酯(DES)誘變處理，在-7 ℃低溫下進行篩選，獲得了抗寒性突變體(表1)。

3.5次生代謝產物生產 植物中含有數量極為可觀的次生代謝物質，目前發現的植物天然代謝產物已超過2萬種，而且還以每年新發現1 600余種的速度遞增[76]。早在1979年，我國學者就提到離體培養的植物組織中可能產生一些物質，尤其是有經濟價值的藥物[77]。例如，中藥草金鐵鎖根部富含皂甙，對一些炎癥和致病性細菌和真菌都有抑制作用，丹參根部含有丹參酮ⅡA、隱丹參酮等脂溶性萜醌類化合物，是我國的傳統中藥，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、養血安神之功效。近年來，次生代謝物質被人類廣泛應用，不僅制成藥品，還有食品添加劑、風味物質、香料、色素、化妝品、生物殺蟲劑和農業化肥等[78]。但由于諸多原因，依靠野生和栽培植物已經遠遠不能滿足日益增長的市場需求。植物組織培養就成為解決這個問題行之有效的方法。紫草系多年生植物，其根部富含紫草寧，Yazaki等[32]研究了在紫草懸浮液中光對紫草寧合成的影響。鄭光植等[33]還開展了三七、人參和西洋參這3種藥用植物的細胞培養，比較了它們愈傷組織培養及細胞懸浮培養中抗癌皂苷Rh1的含量，以期實現其次生代謝物的工業生產。在日本，用培養的人參懸浮細胞生產人參皂苷已形成規模。珍貴中藥植物高山紅景天的根和根莖中含有以紅景天甙為主的次生代謝物質，吳雙秀[34]用植物組織和細胞培養技術，對愈傷組織的狀態進行調控，得到紅景天甙含量高、生長速度快、初步分化的愈傷組織顆粒(表1)。

4 結束語

植物組織培養經過一個多世紀的發展，技術方法已經相當完善。目前組織培養技術大規模應用于具有重要經濟價值的農作物、花卉、果木中，而且也開始應用于草類植物中。但要全面推進組培苗的產業化，還存在一些問題，如生產成本較高；有些植物繁殖系數偏低；技術流程繁瑣等。今后還需要繼續加強植物組織培養方面的研究和探索，全面徹底解決組織培養過程中出現的問題，使組織培養這一生物技術更好地服務于科學研究和生產實踐。

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