白三葉葉蛋白提取及純化工藝

呂宗友，趙國琦，蘇衍菁，鄔彩霞，陸 銀，王小山

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

蛋白質缺乏是世界性的[1]。高等植物的葉片被認為是最有前途的蛋白質資源。植物蛋白因其廉價、資源豐富并能滿足人類和家畜對蛋白質的需求，引起了人們極大的關注[2-3]。開發植物蛋白質資源成為食品業和飼料業一個亟待解決的問題。

葉蛋白又稱綠色蛋白濃縮物(leaf protein concentration，LPC)，是以新鮮牧草或其他青綠植物的生長組織(莖、葉)為原料，經打漿壓榨后利用蛋白質等電點原理從其汁液中提取的高蛋白濃縮物[4]。白三葉(Trifoliumrepens)是一種豆科牧草，其青飼利用期長、粗蛋白質含量高、管理粗放、柔軟細嫩，是重要的種植牧草和觀賞草坪草[5-7]。目前，牧草中的苜蓿(Medicagosativa)[8]、聚合草(Symphytumperegrinum)[9]、串葉松香草(Silpniumperfoliatum)[10]、酸模(Rumexacetosa)[11]、黑麥草(Loliumperenne)[12]的葉蛋白開發均有報道，而白三葉葉蛋白的研究較少。本試驗通過對白三葉葉蛋白提取和純化條件的探討，為其開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 白三葉于2010年4月中旬采自揚州大學動物科技學院草業科學牧草標本區。

1.2儀器 SGL-300食品料理機(天津達康電器公司)；101型電熱鼓風干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；凱式定氮儀(天津玻璃儀器廠)，用于粗蛋白質的測定，按照張麗英[13]提供的方法進行；HSS-I(B)恒溫浴槽(成都儀器廠)；Sartorius酸度計[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；SHB循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.3試驗步驟

1.3.1葉蛋白的提取步驟 均勻稱取鮮樣50 g，剪成1 cm左右的小段，按試驗要求加入規定量的水，打漿4 min，用3層濾布壓濾漿液，棄草渣，將濾液調節到規定的pH值后于水浴中快速加熱至規定的溫度，恒溫不同的時間，得絮凝物，過濾得葉蛋白膏，65 ℃烘干得葉蛋白濃縮物成品(圖1)。

圖1 葉蛋白的提取步驟[1]

1.3.2葉蛋白提取單因素設計 分別以加熱時間、加熱溫度、pH值、料液比和酸的種類(表1)作為影響白三葉葉蛋白提取率及沉淀率的因素，每個處理重復3次。

1.3.3葉蛋白提取的正交設計 在單因素試驗的基礎上，選4因素3水平作正交試驗設計(表2)。由于料液比1∶5太浪費水，所以舍棄該比例。

1.4計算及分析 葉蛋白提取率及蛋白提取率計算，采用張垚等[4]的研究方法。采用SPSS 16.0和Excel分析處理數據。

表1 單因素設計

表2 正交試驗設計

1.5葉蛋白的純化 分別使用四氯化碳、甲醇、無水乙醇、蒸餾水、丙酮5種試劑以料液比為1∶3浸洗新鮮提取的葉蛋白粗提物3 h，3 000 r/min離心10 min，沉淀烘干后測定其純化蛋白質含量。每個設計重復3次。

2 結果

2.1加熱時間對提取率的影響 提取率隨加熱時間的延長而提高，但各處理間差異不顯著(P>0.05)。當加熱時間為9 min時，葉蛋白和蛋白提取率的增長均達到了最大，隨著提取時間的延長，兩項指標均下降然后保持恒定(圖2)。

圖2 加熱時間對葉蛋白純化和提取率的影響

2.2加熱溫度對提取率的影響 隨著溫度的升高，葉蛋白和蛋白的提取率和提取量逐漸增加，當提取的溫度增加到90 ℃時，其提取率均達最大值，但差異不顯著(P>0.05)。當溫度繼續升高時，葉蛋白和蛋白提取率下降(圖3)，但各溫度之間差異不顯著。

圖3 加熱溫度對葉蛋白和蛋白提取率的影響

2.3pH值對提取率的影響 當pH值為4.0時，葉蛋白和蛋白提取率最大，差異均顯著(P<0.05)，之后隨著pH值的升高，其提取率均減少；在pH值升高到6.5時，提取率均最小，隨著pH值的進一步升高，提取率基本不變(圖4)。

圖4 pH值對葉蛋白和蛋白提取率的影響

2.4料液比對蛋白提取率的影響 料液比對葉蛋白和蛋白提取率的影響不大，差異不顯著(P>0.05)。但當料液比為1∶5時，蛋白和葉蛋白提取率最大(圖5)。

2.5酸的種類對蛋白提取率的影響 當試驗中用硝酸調pH值時，葉蛋白和蛋白提取率均達最大值，但差異不顯著(P>0.05)。醋酸和硫酸的提取效果最差(圖6)。

圖5 料液比對葉蛋白和蛋白提取率的影響

圖6 酸對葉蛋白和蛋白提取率的影響

2.6正交設計試驗 通過正交試驗和極差分析可知：對于葉蛋白提取率來說，按照極差R的大小可得出影響主次因素為C>B>A>D，即pH值>溫度>時間>料液比；對葉蛋白沉淀率來說，影響主次因素為C>A>B>D，即pH值>時間>溫度>料液比(表3)。表中得出的最優結果是加熱時間9 min，溫度80 ℃，pH值4.0，料液比1∶2。經試驗驗證，當按照最優結果進行提取時，葉蛋白提取率可達2.44%，葉蛋白沉淀率可達38.94%，正交設計所得出的為最優工藝。

2.7不同純化劑對葉蛋白純化的影響 未使用純化劑時，葉蛋白的純度在50%左右。使用純化劑時，葉蛋白純度達到了70%左右。其中，純化劑對葉蛋白純度的影響依次為甲醇>乙醇>丙酮>四氯化碳>水，但各種純化劑之間差異不顯著(P>0.05)(圖7)。

表3 正交試驗設計結果

3 討論

3.1單因素對白三葉葉蛋白提取率的影響 葉蛋白的提取方法有水溶液提取法、加熱法、酸堿法、純蛋白質沉淀法、鹽析法、凝聚劑沉淀法、超濾法、電濃縮法、反膠團相轉移法、有機溶劑沉淀法、發酵酸法等等。其中，直接加熱法和酸化加熱法是最常用的方法，兩種方法的蛋白提取率均較高，成本均較低，適合大劑量葉蛋白的提取[14-15]。有研究[16]表明，酸化加熱法能終止脫鎂葉綠素的形成而避免動物食用后產生過敏反應，但該方法提取的葉蛋白絮凝物結構疏松，不易過濾分離，同時還加速不飽和脂肪酸的氧化，使胡蘿卜素的損失增多。本試驗在酸化加熱時發現，低pH值適合蛋白質在等電點沉淀及加熱鈍化了蛋白酶活性，從而使葉蛋白的提取率最高。葉蛋白的提取率與酸的種類有關，鹽酸沉淀的葉蛋白的量較硫酸，硝酸，醋酸大[17]；高莉[14]的研究也表明，鹽酸絮凝的情況下，馬齒莧(Portulacaoleracea)的葉蛋白提取率及沉淀率均增大，這與本試驗中硝酸能提高葉蛋白的提取率的結果不一致，可能與植物種類不同有關。

加熱時間的長短影響葉蛋白的提取。試驗中當加熱時間小于9 min時，由于加熱時間過短，蛋白質沉淀不完全，當加熱時間大于9 min時，葉蛋白的沉淀不再增加，反而有減少的趨勢，這與王桓[16]的研究結果一致。因為蛋白質的絮凝是一個需要能量的反應，隨著加熱時間的延長，沉淀所需的能量才能達到峰值，但當達到所需能量的峰值之后，對反應會造成負影響，使絮凝速度和絮凝的積累量都減少[4]。由于試驗各種處理中得到的未純化葉蛋白蛋白質含量基本一致，所以純化蛋白提取率的趨勢和葉蛋白也基本一致[4]。

溫度的高低影響蛋白質的沉淀。本試驗中當溫度為90 ℃時，葉蛋白的提取率達到最大，當溫度繼續升高時，葉蛋白的提取率反而下降，這可能是溫度升高雜質沉淀量增加而導致葉蛋白的提取率下降[12]。

蛋白質分子的電荷和溶解度可隨環境的pH值的變化而變化。pH值較低時，堿性氨基酸的支鏈功能基及酸性氨基酸的羧基質子化，蛋白質帶正電荷；pH值較高時，堿性與酸性功能基中的質子被移除，蛋白質帶負電荷；在某一特定pH值時，蛋白質為電中性[8]。試驗中當pH值為4.0時，葉蛋白提取量達最大值，此時葉蛋白的溶解度最小；當pH值接近中性時，大量的葉蛋白溶解，這與Dalev等[2]的研究結果一致。當pH值繼續增加時，更大量的葉蛋白溶解[14]。

影響葉蛋白提取率的最主要原因是其葉蛋白能否提取完全。理論上，當料液比越大時，葉蛋白提取越完全，而適中的料液比能以最少的提取液獲得最大的葉蛋白。本試驗中當料液比小于1∶2時，葉蛋白未完全溶解，葉蛋白的提取率低；當料液比為1∶3時，葉蛋白提取率較高；之后隨著料液比的增加，葉蛋白提取率不再增加。

3.2正交設計對葉蛋白提取的優化 本試驗中正交設計影響的主次因素為C>B>A>D，即pH值>溫度>時間>料液比。pH值在試驗中占主要因素，這與吳峰華等[18]的研究結果一致。pH值在4.0時，葉蛋白質處在等電點，蛋白質分子以雙極離子存在，總凈電荷為零,顆粒無電荷間的排斥作用，易凝集成大顆粒，因而最不穩定，溶解度最小，易沉淀析出。當溫度為80 ℃時，能迅速使最適溫度分別為55 ℃及45 ℃的血紅蛋白水解酶和羧肽酶鈍化，降低了蛋白質的降解；當溫度低于80 ℃時，由于溫度太低，部分巰基蛋白酶的活性仍很高，導致蛋白質降解損失升高；當溫度高于80 ℃時，蛋白質又被溶解，導致溶解損失。但張垚等[4]的研究結果表明，溫度的影響較pH值的大，可能是因為植物種類不同，其組成蛋白質的氨基酸的酸堿性不同，受pH值的影響不同。

3.3葉蛋白的純化 葉蛋白中含脂化合物、葉綠素以及類胡蘿卜素等植物色素和導致葉蛋白有不良風味和顏色的多酚類物質，烘干后發黑，影響了其利用。有機溶劑可除去這些化合物[19]，且純化劑的使用能提高葉蛋白的純度近20%，粗制得到的葉蛋白呈墨綠色，經過不同純化劑的純化后，產品色澤變淺，青草味消失，葉蛋白的蛋白質含量明顯提高[20]。本試驗的純化劑為醇類物質時純化效果最好。黃威[21]也認為醇類的濃度越高，蛋白質的含量也越高，醇提法可除掉類脂化合物、葉綠素以及類胡蘿卜等植物色素和多酚化合物。水的效果最差，是因為葉綠素類物質不溶于水。

4 結論

白三葉葉蛋白單因素提取的最佳參數為加熱時間9 min，溫度90 ℃，pH值4.0，料液比1∶2，沉淀的酸為硝酸。通過正交試驗設計可知葉蛋白提取的最佳工藝為加熱時間為9 min，溫度為80 ℃，pH值為4.0，料液比為1∶2。純化葉蛋白的最佳試劑是甲醇，以料液比1∶3純化葉蛋白粗提取物最有效。

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