野牛草種質基于SRAP標記的遺傳多樣性研究

周瑩潔，王顯國，張新全

(1.四川農業大學草業科學系，四川 雅安 625014；2.中國農業大學草地研究所，北京 100193)

野牛草(Buchloedactyloides)別名水牛草、牛毛草，禾本科畫眉草亞科野牛草屬多年生暖季型C4草本植物，原產于北美中部半干旱溫帶和亞熱帶地區，是北美干草原的特有草種[1]。由于它具有抗逆性強，易養護管理等優良的坪用特性，因此從最初主要被用作牧草，逐漸被用作園林綠化植物。20世紀40年代作為水土保持植物引種到我國，已在西北、華北及東北地區廣泛種植。近年來，隨著冷季型草坪草耗水量大、養護強度高等問題的突顯，野牛草成為北方和缺水地區綠化及水土保持的首選草種。

至今，關于野牛草遺傳多樣性的研究多見于國外的報道。Huff等[2]用RAPD標記發現野牛草自然異性雜交群體內多樣性大于群體間多樣性。Zhang等[3]對野牛草遺傳多樣性RAPD分析得出10份野牛草種質相似系數分布范圍為0.30～0.89。Budak等[4-5]利用SRAP標記分析53份野牛草基因型之間的遺傳多樣性及表型關系，以及不同倍性水平野牛草的遺傳多樣性，結果表明控制性狀的基因型極易區分草坪草的品質和顏色，各倍性基因型之間的遺傳距離為0.33～0.99，說明 SRAP標記是遺傳多樣性評價、鑒別特異基因型及從分子水平上分析野牛草栽培種的進化與培育的有效工具；同時還利用ISSR、SSR、RAPD和SRAP四種分子標記分析了種子繁殖類型和營養體繁殖類型野牛草之間的遺傳關系，這些標記都可區分研究材料，其中SRAP標記多態性豐富，適合應用于野牛草近緣栽培種遺傳多樣性研究。劉莉等[6]利用ISSR分子標記和表型性狀研究野牛草實生苗群體內的多樣性，研究發現野牛草群體內的遺傳多樣性較高，相似系數為0.58～0.82，ISSR標記聚類結果與形態特征沒有明確的對應關系。

相關序列擴增多態性 (sequence-related amplified polymorphism,SRAP)標記自從2001年開發以來，已被廣泛應用于多種植物的圖譜構建、基因定位、比較基因組學和遺傳多樣性分析等研究領域[7]。在草業科學領域中，已有關于鴨茅(Dactylisglomerata)[8]、狗牙根(Cynodondactylon)[9]和結縷草屬[10]等植物SRAP標記遺傳多樣性的報道。

目前國內還未見有關野牛草SRAP遺傳多樣性研究的報道，本研究采用SRAP分子標記技術對來自31份國外野牛草種質資源進行分析，為野牛草新品種的培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1供試材料 供試材料為中國農業大學草業科學系收集的31份材料，包括28份野生材料和3個栽培品種。其中29份來自美國，1份來自加拿大，另1份來自日本(表1)。

表1 供試材料

1.2基因組DNA提取與檢測 采用CTAB方法提取DNA[11]，提取的DNA儲存于4 ℃冰箱中備用。在0.8%的瓊脂糖凝膠上，1×TBE緩沖液條件下電泳，以已知含量的λDNA為對照，檢測DNA的濃度[12-13]。

1.3PCR擴增體系 SRAP標記引物序列來自Li和Qurios[14]及Guo和Luo[15]的報道，12個上游引物和19個下游引物組合成228對引物序列，由上海生工生物公司合成。選取4個DNA質量較高且田間試驗性狀表現差異較大的材料對引物進行篩選，選出19對條帶清晰，多態性好的引物組合用于野牛草SRAP遺傳多樣性研究，引物序列見表2。

反應總體積為15 μL，反應最終濃度：30 ng DNA，0.4 μmol/L引物，0.75 U Taq DNA 聚合酶，250 μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2。PCR擴增反應在Biometra PCR儀上進行，擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

擴增產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉=39∶1，1×TBE)電泳分離。在200 V電壓下電泳120～150 min，電泳結束后快速銀染檢測，凝膠用數碼相機拍照并保存[16]。

1.4數據統計及分析 對清晰可重復的DNA條帶進行統計，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，不同引物擴增的結果構成原始的“0,1”二元數據矩陣。按Nei-Li[17]方法計算供試材料間遺傳相似系數(GS,即Dice系數)，GS=2Nij/(Ni+Nj),式中，Ni為材料i中出現的譜帶數，Nj為材料j中出現的譜帶數，Nij為材料i和材料j共有的譜帶數。利用NTSYS-pc軟件按Nei-Li遺傳相似系數的非加權成對算術平均法(UPGMA)進行各種質材料間的聚類分析[18]。進行基于遺傳相似系數的主成分分析(principal components analysis,PCA),依據引起變異的最大第1主向量、第2主向量作出各份種質材料的2-D散點分布圖。

表2 用于野牛草SRAP分析的引物序列

2 結果與分析

2.1供試材料SRAP擴增產物的多態性 利用19對引物組合對31份野牛草基因組DNA進行SRAP擴增，共擴增出312條清晰的條帶。其中多態性條帶271條，多態性條帶比率(percentage of polymorphic band,PPB)為85.79%，擴增DNA片段大小集中在50～1 500 bp。引物組合Me6-Em16擴增出最多的26條帶，Me1-Em16擴增的條帶最少，僅有7條。平均每對引物擴增出16.42條帶，其中14.26條具有多態性，每對引物擴增的多態性位點百分率為69.23%～100%(表3)。

表3 SRAP標記引物擴增結果

2.2野牛草SRAP標記特異性缺失標記及特異性標記 在31份野牛草基因型中，15號野生材料在Me3-Em13引物組合擴增時缺失一條50 bp左右擴增帶，可以作為15號材料種質鑒定的特異標記。在Me10-Em15擴增產物中，品種Texoka在50 bp附近出現特異性條帶，其他材料都沒有此條帶，同時Me3-Em5對15號材料能擴增出400 bp處的特異帶。這些特異性缺失標記和特異性標記都可以作為野牛草品種鑒定的重要依據。

2.3供試材料的遺傳相似性 對擴增結果采用Nei-Li相似系數的計算方法，得到相似性矩陣。31份野牛草供試材料的GS變異范圍為0.586 5～0.916 7，平均GS值為0.669 1。從遺傳相似矩陣可以看出，27號和31號材料的遺傳相似性最高，親緣關系最近，18號和29號材料之間的遺傳相似性最小，遺傳距離最大表明親緣關系最遠。這些結果說明供試野牛草之間差異明顯，具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.4供試材料的聚類分析和主向量分析 基于Nei-Li相似系數，采用NTSYS-pc繪制出UPGMA聚類圖(圖1)。從聚類圖可以看出，把31份材料聚為兩大類，第一類共包括了25份材料，其中包括20份美國野生材料，3份栽培品種和1份加拿大和1份日本的野生材料，第二類包括了6份美國野生材料。同時，基于Nei-Li相似系數，利用NTSYS-pc對這些材料進行主向量分析，繪制出前兩個主向量2-D散點分布圖(圖2)。從圖2 可知，第一主向量和第二主向量分別能夠接受總的遺傳變異的21.98%和1.06%。主向量分析的結果和聚類分析結果基本一致，兩類材料可明顯的區分開來。

3 討論

通過SRAP標記對31份野牛草材料進行PCR擴增，分析其遺傳狀況。本研究得到的多態性比率為85.79%。雖然低于此前Budak等[4-5]利用SRAP技術對野牛草遺傳多樣性研究的結果，但是高于ISSR和RAPD兩個標記的結果。本研究利用16個引物組合共擴增出271條多態性帶，平均每個引物組合擴增多態性帶14.26條，說明SRAP對野牛草的擴增效率較高，可用于標記評價野牛草基因型的遺傳分析，也適用于對大量種質的遺傳變異檢測。

由于SRAP標記的引物特點，此標記在重要基因性狀標記的輔助選擇上起到了重大的作用。Li等[19]在大白菜(Brassicacampestris)中發現與雄性不育基因有關的SRAP標記，并且篩選到與芹菜(Apiumgraveolens)病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標記。本研究在對31份野牛草材料進行SRAP標記分析時發現，某些材料用特定的引物組合擴增以后，會出現一些特異性缺失的條帶及特異性的條帶，這些特異性缺失條帶和特異性的條帶可為野牛草的品種鑒定及親本選擇提供必要的理論依據。此外，野牛草是比較少見的雌雄異株禾本科草坪草，如能利用SRAP標記篩選到與其性別相關的基因，可為野牛草性別早期鑒定和揭示性別分化程序表達的機理提供理論基礎和技術支持。

圖1 31份野牛草材料基于Nei-Li相似系數的UPGMA聚類

圖2 基于SRAP 數據的野牛草材料主向量分析

31份材料中，27號和31號材料的遺傳關系最近，18號和29號材料之間的遺傳相似性最小，親緣關系最遠。從供試材料的聚類圖和主向量分析可看出，地理來源相同的野牛草材料沒有聚為一類，與預期相比，來自美國的29份材料并沒有單獨的聚在一類，不符合地理生態環境的分布。有較多關于牧草或草坪草遺傳多樣性的文獻都報道相似生境或地理來源的類群會優先聚為一類[8,20-21]。本研究這種聚類不符合地域性分布規律的原因可能有以下幾種：一是樣本的數量有限，來自日本和加拿大的種質數量太少，各自只有一份，導致其特異帶在總條帶中的比例很小，可能對各群體遺傳多樣性指數的比較產生了影響，有研究[22]指出，在盡量多的起源地取代表性的種源進行研究才能得到更加準確的結果；二是與野牛草混合生殖方式和基因突變有關；三是這些材料都是在20世紀80和90年代引入中國，相同的生境條件產生了具有相同的選擇壓力，形成了相似的生態類型。

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