葡萄酒野生優良酵母菌株的篩選

張敬慧 (宜賓職業技術學院,四川宜賓644003)

湯欽林 (荊州職業技術學院,湖北荊州434020)

葡萄酒是采用新鮮葡萄或葡萄汁經完全或部分酒精發酵而得到的飲料。葡萄酒的釀造是通過酵母菌的作用,將葡萄原料中的各種潛在質量在酒中充分圖現出來[1]。葡萄酒具有開胃健脾、防治心血管病、防癌作用、殺菌作用、葡萄酒養顏益壽等作用,隨著人們生活水平的提高,酒飲料的保健功能越來越受到人們的重視,中高端葡萄酒的品質也受到眾的關注。葡萄酒的品質除了取決于原料和釀制工藝外,釀酒酵母菌的品質也直接影響葡萄酒的產量和質量。優良葡萄酒酵母應具有生長速率快、耐高糖、耐SO2、耐酸、發酵平穩、酒精產率高、發酵完全等特性[2]。本研究根據宜賓本地特色,從土壤中選育出適合于葡萄酒生產的菌株,對于充分利用本土微生物資源,開發特色優質葡萄酒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌株 供試的4株野生釀酒酵母菌菌株分別從四川宜賓2個釀酒葡萄產區生產土壤中采集,并經分離純化后得到的,分別命名為Yp-1、Yp-2、Yp-3、Yp-4。對照菌株是由當地葡萄酒生產企業提供的活性干酵母。

(2)培養基 菌體培養用固體培養基為馬鈴薯培養基、MEA培養基[5];發酵培養基[6]為宜賓2010年產赤霞珠葡萄汁,pH3.5～3.6,糖度0.41～0.43g/mL。

1.2 方法

(1)酵母菌的純化 用五點取樣法從葡萄地土壤中取樣,用四分法獲取樣品20～30g,壓碎后放入盛有40mL無菌水的250mL三角瓶[3],取上清液1mL,依次按平板稀釋法進行稀釋,從10-3mg·L-1開始馬鈴薯培養基平板培養,直到出現單個菌落。挑取單個菌落,用MEA培養基進行分離。每皿加青霉素300mg·L-1,25～28℃培養,重復純化培養直到獲得純菌落。

(2)酵母菌的耐性試驗 采用乙醇體積分數分別為11%、13%、15%、17%、18%,檸檬酸pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,葡萄糖濃度分別為 0.37、0.40、0.43、0.47、0.50g/mL。SO2濃度分別為10、15、20、25、30mg·L-1的帶有杜氏管的液體培養基10mL,分別接種已活化的菌液200μ L,接種量為106個/mL,25℃溫度培養,記錄各單因素耐性試驗條件下各酵母菌株的72h產CO2量與啟動發酵的時間。

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對各酵母菌株發酵的影響

從圖1可以看出,隨著乙醇體積分數的升高,野生菌啟動發酵的時間推遲,其中菌株Yp-3、Yp-4在同等條件下啟動發酵最快。菌株Yp-3、Yp-4與對照菌株比較發酵啟動時間很接近,在乙醇體積分數為15%左右時,所有菌株發酵啟動時間相對最短。但當乙醇體積分數≥18%時,各菌株均不能啟動發酵。

圖1 不同體積分數乙醇下各酵母菌株啟動發酵的時間

從圖2可以看出,菌株Yp-3、Yp-4在乙醇體積分數低于15%左右的條件下產氣能力良好,在乙醇體積分數為17%的條件下仍可產少量氣體,與對照菌株活性干酵母性能接近。而菌株Yp-1、Yp-2在乙醇體積分數為15%的條件下產氣量下降明顯,可能是由于酵母生長受抑制,圖2表明其耐受力較差,而菌株Yp-1在乙醇體積分數為17%的條件下幾乎不產氣,對乙醇的耐受力最差。乙醇體積分數為17%的條件對所有酵母菌株的生長繁殖具有明顯抑制作用,在野生菌中菌株Yp-4相對耐受力最好。在乙醇體積分數為18%時所有菌均不生長,酵母耐受性降低可能是CO2毒性所致。

圖2 不同體積分數乙醇下各酵母菌株的72h產CO2量

2.2 SO2濃度對各酵母菌株發酵的影響

葡萄酒生產過程中,需加入適量的SO2,達到抑制有害微生物、抗氧化、護色等作用。優良葡萄酒酵母需在SO2濃度為15～20mg·L-1的條件下均能較好地抑制雜菌,保證正常發酵。

圖3表明,4株野生菌在SO2濃度為10～25mg·L-1的條件下均能啟動發酵,且時間接近,為7～12h。相對而言,菌株Yp-3、Yp-4與對照活性酵母菌的啟動時間更接近。

從圖4可以看出,不同SO2濃度對酵母產氣效果影響不是特別大,均能產氣,當SO2濃度為20mg·L-1時菌株Yp-1、Yp-4產氣效果相對最好,證明野生酵母菌發酵產氣最適SO2濃度在20mg·L-1左右。

圖3 不同SO2濃度下各酵母菌株啟動發酵的時間

圖4 不同SO2濃度下各酵母菌株的72h產CO2量

2.3 葡萄糖濃度對各酵母菌株發酵的影響

在葡萄糖濃度為0.37～0.50g/mL條件下,各菌株都能啟動發酵;但隨著葡萄糖濃度增加,啟動速率會下降,啟動時間會延遲 (圖5)。

圖5 不同葡萄糖濃度下各酵母菌株啟動發酵的時間

當葡萄濃度高于0.50g/mL時,菌株Yp-1和Yp-4發酵產CO2量相似,啟動時間也較接近。證明這2種野生菌耐高糖的能力較強。

2.4 pH對各酵母菌株發酵的影響

由圖8可以看出,當pH在2.0時,菌株Yp-3、Yp-4和活性干酵母能啟動發酵外,其余野生菌均不能啟動發酵,菌株Yp-3、Yp-4較其他菌株具有更強的耐酸性。不同酸度條件下各酵母菌株的72 h產CO2量相差較小。總體來看,起酵時間隨pH的降低而逐漸延長。當pH3.5左右時,酵母菌發酵效果相對較好。

圖6 不同葡萄糖濃度下各酵母菌株的72h產CO2量

圖7 不同pH條件下各酵母菌株啟動發酵的時間

圖8 不同 pH條件下各酵母菌株的72h產CO2量

3 小結

本研究結果表明,4株野生菌對高乙醇、高葡萄糖濃度等條件均具有較好的耐受性,能夠啟動酒精發酵進程。但菌株Yp-1、Yp-2、Yp-3在同等酸度梯度下發酵啟動時間長且不能耐受酸,因此予以淘汰。綜合各項發酵性能,Yp-4對乙醇的耐受性優于其他菌株,并在高酸的條件下能夠較快啟動發酵,與現有的活性干酵母耐受性相近,為最優菌株,更適宜宜賓當地葡萄酒的生產。

[1]李記明.酵母活性劑在葡萄酒釀造中的應用研究[J].釀酒科技,2001,(4):88-89.

[2]程 超,韓北忠,陳晶瑜,等.本土葡萄酒釀酒酵母發酵性能的比較 [J].中國釀造,2008,(17):9-10.

[3]戰景娟,金勇鍵.山葡萄選育酵母的應用 [J].釀酒,2004,3l(2):80-81.

[4]秦偉帥,王海燕,李 超,等.不同葡萄酒酵母耐受性試驗比較 [J].中外葡萄與葡萄酒,2009,17(9):16-19.

[5]王 慧,張立強,劉天明,等.產地葡萄酒優良酵母菌株的篩選及鑒定 [J].釀酒科技,2007,(9):29-34.

[6]吳 帥,肖冬光,原通磊,等.高耐性釀酒酵母菌種的篩選 [J].釀酒科技,2006,(9):37-39.