尿酸對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響及其機制

宋彥索愛琴丁旭萌王天虎楊國東賈蘭梅

·論 著·

尿酸對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響及其機制

宋彥*索愛琴△丁旭萌*王天虎*楊國東*賈蘭梅*

目的 觀察尿酸對阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）大鼠學習記憶能力的影響，并探討作用機制。方法 Morris水迷宮實驗篩選出90只大鼠，隨機分為空白對照組，模型對照組，尿酸處理組（1～4組），每組15只。Aβ1－42海馬注射制作AD模型，用Morris水迷宮實驗觀察干預前后大鼠空間學習記憶能力的變化，丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒測定海馬區MDA的含量；免疫組化染色測定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（caspase-3）的表達。結果 與空白對照組比較，模型對照組大鼠空間學習記憶能力下降（P＜0.01），海馬區MDA含量和caspase-3明顯增高（P＜0.01）；與模型對照組比較，2種劑量尿酸處理組大鼠的學習記憶能力明顯改善（P＜0.01），海馬區MDA和caspase-3的表達減少（P＜0.01）。結論 尿酸具有改善AD大鼠空間學習記憶作用，可能與抗氧化應激作用及抑制海馬中caspase-3表達有關。

尿酸 阿爾茨海默病 學習記憶 丙二醛 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）好發于中老年人的一種常見中樞神經系統變性疾病，氧化應激學說在AD發病中起重要作用［1］。尿酸是一種重要的生理性的天然抗氧化劑，具有抗氧化應激和保護神經元的作用。本實驗探討尿酸（uric acid，UA）對AD模型大鼠學習記憶能力的影響及其機制，為研究AD的發病機制及臨床應用UA治療AD提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 鄭州大學實驗動物中心提供的90只Sprauge-Dawley（SD）大鼠，雄性、健康、體質量（280±12）g。Aβ1－42（美國Sigma公司），500 μg Aβ1-42溶于125 μL滅菌生理鹽水中，制成4 μg／μL濃度，置于－70℃超低溫冰箱中保存，用前置于37℃細胞培養箱中孵育1周，使其成為凝聚態Aβ1-42。尿酸、兔抗鼠caspase-3單抗為美國Sigma公司；尿酸檢測試劑盒（南京建成）；SP免疫組化染色試劑盒、丙二醛（MDA）氧化應激檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 大鼠尿酸水平測定 SD大鼠尾靜脈采血約1 mL于抗凝管內，在離心機內離心15 min，轉速5000 r／min，離心后取200 μL上清液于EP管，檢測尿酸水平。

1.3 動物的分組與模型的制備 測定大鼠的血尿酸水平［2］在（1±0.1）mg／kg生理范圍內，經Morris水迷宮實驗篩選出90只大鼠，隨機分為空白對照組，模型對照組，尿酸處理組（尿酸處理1～4組），每組15只。10%水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉SD大鼠，將其固定于立體向儀上，使前后囟位于同一水平面上。參照《大鼠腦立體定位圖譜》［1］，定位于前囟后3.0 mm、正中矢狀縫左右旁開3.0 mm、顱骨表面下3.5 mm為雙側海馬背側注射點。用10 μL微量注射器10 min內緩慢將Aβ1－42注入模型對照組和尿酸處理組，空白對照組注射等容積的生理鹽水，所有大鼠海馬內注射Aβ1－42每側均為2.5 μL（4 μg／μL），留針10 min，然后緩慢退出，縫合皮膚。造模成功后第1～21 d尿酸處理1～4組分別腹腔注射1、5、10、20 mg／（kg·d）的尿酸，空白對照組與模型對照分別腹腔注射等劑量生理鹽水。 在治療的21 d期間中，模型對照組、尿酸處理2、4組各死亡1只大鼠，余下87只是合格的。大鼠行為學的變化可以證實造模成功，即Aβ1-42海馬區注射是成功的。

1.4 空間記憶能力檢測 造模后第22 d采用Morris水迷宮實驗進行空間記憶能力的測定。測定程序為定位航行試驗：每天上午各訓練2次，共訓練16次，將大鼠面向池壁分別從4個點放入水中，記錄其在3 min內尋找到并爬上平臺的時間和路程，即逃避潛伏期。空間探索實驗：在定位航行實驗后去除平臺，然后任選一個入水點，將大鼠放入水池中，記錄其在3 min內跨越原平臺的次數。

1.5 取材 行為學檢測結束后即造模后第23 d，腹腔內注射10%水合氯醛（300 mg／kg），將大鼠仰臥位固定于手術板上，暴露心臟，經主動脈灌注后用剪刀快速由頸部剪下大鼠頭顱，將腦組織從顱腔內移出置于4%多聚甲醛固定2～4 h，然后置于30%蔗糖溶液，待沉底后取出大腦，沿中線離斷兩側大腦半球，用竹刀沿海馬的包膜分離出兩側完整的海馬，冰生理鹽水充分沖洗，濾紙吸干，稱重，置于液氮中保存。每組中取7只大鼠的雙側海馬制作切片，常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續冠狀切片，片厚5 μm。

1.6 MDA測定 每組中取8只大鼠海馬用組織勻漿器制成組織勻漿，以12000 r／min低溫離心15 min，取上清液，MDA檢測試劑盒測定MDA的含量。

1.7 caspase-3免疫組化染色 免疫組化染色用SP法，按說明書進行操作，DAB顯色系統，鏡下觀察顯色情況。陰性對照組以PBS代替一抗進行孵育。每只動物選取相似平面的切片各5張，運用網格目鏡測試，于40×10倍光鏡下分別計數海馬CA1區單位面積內caspase-3陽性細胞數目，每張切片分別選取雙側海馬視野各2個，取其均數作為陽性細胞的數目。

1.8 統計學方法 采用SPSS 13.0進行統計學處理。數據以表示。組間比較采用單因素方差分析，組內采用最小有意義的t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 大鼠學習記憶能力測定 各組之間潛伏期、搜索路徑長度、跨越原平臺次數不等或不全相等（分別 F＝12.345，P＜0.01；F＝35.40，P＜0.01；F＝11.20，P＜0.01）。與 空白對照組組比較，模型對照組和尿酸處理1～4組學習記憶能力明顯下降（P＜0.01）；與模型對照組比較，尿酸處理2、3組學習記憶能力增強（P＜0.01），模型對照組和尿酸處理1、4組之間比較差異無統計學意義（P＞0.01）；尿酸處理1～4組之間比較差異有統計學意義（P＜0.01），尿酸處理2、3組學習記憶能力增強（見表1）。

2.2 MDA含量檢測 各組之間MDA含量不等或不全相等 （F＝7.18，P＜0.01）。與空白對照組比較，模型對照組和尿酸處理1～4組MDA含量增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，尿酸處理2、3組MDA含量減少（P＜0.01），尿酸處理 1、4組與模型對照組之間比較無統計學意義 （P＞0.01）；尿酸處理1～4組之間比較差異有統計學意義（P＜0.01），尿酸處理2、3組MDA含量減少（見表2）。

2.3 各組caspase-3免疫組化染色陽性細胞數 各組之間caspase-3陽性細胞數不等或不全相等（F＝35.78，P＜0.01）。與空白對照組比較，模型對照組和尿酸處理1～4組caspase-3陽性細胞數明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，尿酸處理2組、尿酸處理3組caspase-3陽性細胞數明顯減少（P＜0.01），尿酸處理1、4組與模型對照組之間比較差異無統計學意義（P＞0.01）；尿酸處理4組之間比較差異有統計學意義 （P＜0.01），尿酸處理2組、尿酸處理3組caspase-3陽性細胞數減少（見表3、圖1）。

表1 各組大鼠學習記憶能力成績（±s）

表1 各組大鼠學習記憶能力成績（±s）

組別空白對照組模型對照組尿酸處理1組尿酸處理2組尿酸處理3組尿酸處理4組n 15 14 15 14 15 14潛伏期（s）7.0±2.8 38.2±15.9 35.3±13.4 18.6±5.3 17.3±5.2 30.6±12.7搜索路徑長度（cm）105±35 324±39 315±37 219±29 216±28 309±33跨越原平臺次數（次）18.5±6.5 14.3±3.5 13.9±3.2 16.9±6.2 17.2±5.9 13.7±3.2

表2 各組大鼠海馬區MDA含量

表3 各組大鼠caspase-3陽性細胞數計數（1個400倍視野）

3 討論

到目前為止，AD的病因及發病機制仍不十分清楚，近年來研究發現氧化應激［2］在AD的發病中起重要作用。氧化應激可造成大量活性氧的產生，表現為血清中MDA含量升高和SOD活力、GSH-PX活力降低，導致機體脂質代謝失衡，并繼發細胞損傷，導致細胞凋亡［3］。Butterfield等［4］的實驗表明，AD模型鼠腦內脂質過氧化反應增強。林玉坤等［5］研究表明輕微認知障礙患者腦中即可發現蛋白質的氧化和脂質的過氧化。Caspase-3是細胞凋亡的敏感指標，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的最終通路［6］。尿酸是嘌呤的代謝終產物，是一種重要的生理性的天然抗氧化劑、鐵螯合劑、自由基清除劑，能通過多種途徑抑制一系列繼發性損傷和神經細胞凋亡，具有抗氧化應激和保護神經元的作用［7］，這在AD動物模型中也得到了證實［8］。相反，也有研究報道尿酸水平過高，反而會增加氧化損傷［9］。

尚秀麗等［10］測定32例AD患者顯示較低血尿酸水平，國外Polidori等［11］和Kim等［12］研究證實AD和輕度認知障礙患者血尿酸也處于較低水平。最新研究結果發現，較高血漿濃度水平的尿酸能夠降AD的發病率，改善AD患者的認知功能障礙及AD患者的預后［13］。但Schretlen等［14］對共住一處有96例AD患者進行研究表明高于正常水平尿酸的人員也存在記憶和認知功能的減退。

基于尿酸具有抗氧化的作用和AD血清中低尿酸水平特點，我們用不同劑量的尿酸腹腔注射治療AD模型大鼠，結果表明：5、10 mg／（kg·d）兩種劑量尿酸處理組大鼠的潛伏期和搜索路徑較模型組明顯縮短（P＜0.01），跨越平臺次數較模型組增加（P＜0.01），認知功能明顯改善（P＜0.01）；模型組大鼠海馬區的MDA含量和凋亡因子caspase-3表達顯著增強，而5、10 mg／（kg·d）兩種劑量尿酸處理組大鼠海馬組織中MDA含量和caspase-3表達明顯下降（P＜0.01），差異具有明顯的統計學差異。可見，尿酸具有抗氧化作用，抑制了大鼠海馬組織Caspase-3的表達，從而減輕海馬組織的損害，改善了大鼠的認知功能。

圖1 免疫組化染色SABC法檢測各組大鼠海馬CA1區caspase-3陽性細胞。標尺10 μm A：空白對照組，caspase-3陽性神經元少；B：模型對照組，caspase-3陽性神經元增多；C：5 mg／（kg·d）尿酸干預組，caspase-3陽性神經元較多

該研究表明尿酸改善AD大鼠的學習記憶能力存在量效關系，5、10 mg／（kg·d）組改善學習記憶能力最佳，超過此劑量范圍保護作用降低甚至消失，其機制可能是尿酸在一定范圍內具有抗氧化應激能力，保護海馬神經元，從不同途徑影響到大腦皮質功能最終改善認知功能，表明對尿酸水平的調控，對于改善AD認知功能、延緩病情進展，提高療效具有重要的意義。實驗的不足之處是沒有設置高尿酸血癥大鼠作為對照組。雖然我們在動物實驗中尿酸治療AD動物模型取得了明顯效果，但尿酸應用于AD患者還有一段距離，尚需進行進一步的研究。

［1］ 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜 ［M］.人民出版社，1991.

［2］Kim TS，Lim HK，Lee JK，et al.Changes in the levels of plasma soluble fractalkine in patients with mild cognitive impairement and Alzheimer's disease［J］.Neurosci lett，2008，436（2）：196－200.

［3］Butterfield DA，Reed T，Newman SF，Sultana R.Roles of amyloid β-peptide-associated oxidative stress and brain protein modification in the pathogenesis of Alzheimer's disease and Mild cognitive impairment［J］.Free Radic Biol Med，2007，43：658－677.

［4］ 吳月娥，宋成成，李婷婷，等.阿爾茨海默病治療進展［J］.承德醫學院學報，2009，26（1）：100－101.

［5］ 林玉坤，曾園山，屈澤強，等.氧化應激與阿爾茨海默病［J］.解剖學研究，2009，31（1）：67－68.

［6］HuiMT，Wen WW，Yan QG.Progress in programmed cell death pathways［J］.Chinese Journal of CellBiology，2008，30：563－568.

［7］Weisskopf MG，O'Reilly E，Chen H，et al.Plasma urate and risk of Parkinson's disease［J］.Am J Epidemiol，2007，166（5）：561－567.

［8］Duan RS， Chen MO， et al.Decreased fractalkine and increased IP-10 expression in aged brain of APP transgenic mice［J］.Neurochem Res，2008，33（6）：1085－1089.

［9］ 商秀麗，張鳳英，孟令慧，等.阿爾茨海默病患者血尿酸水平的檢測及意義［J］.中國醫科大學學報，2009，38（5）：333－334.

［10］Polidori MC，Mattioli P，Aldred S，et al.Plasma antioxidant status， immunoglobulin g oxidation and lipid peroxidation in demented patients： relevance to Alzheimer disease and vascular dementia.Dement Geriatr Cogn Disord，2004，18：265－270.

［11］Kim TS，Pae CU，Yoon SJ，et al.Decreased plasma antioxidants in patients with Alzheimer's disease.Int J Geriatr Psychiatry，2006，21：344－348.

［12］Michael C，Irizarry，Rema Raman，Michael A.Schwarzschild，et al.Plasma urate and progression of mild cognitive impairment［J］.Neurodegener Dis，2009，6（1－2）：23－28.

［13］Schretlen DJ，Inscore AB，Jinnah HA，et al.Serum uric acid and cognitive function in community-dwelling older adults［J］.Neuropsychology，2007，21（1）：136－140.

The effects of uric acid on learning-memory ability in the rat model of Alzheimer disease.

SONG Yan，SUO Aiqin，DING Xumeng，WANG Tianhu，YANG Guodong，JIA Lanmei.Department of Neurology，the Second People's Hospitol of Nanyang，Nanyang 473012；Department of Neurology，People’s hospital，Henan Province，Zhengzhou 450014，China.Tel：0377－61609105.

Objective To investigate the effects of uric acid on learning-memory ability in the rat model of Alzheimer disease induced by Aβ1-42.Methods SD rats were divided into blank control group，AD group，uric acid treatment group（group 1－4）（n＝15）.AD animal model was established by injecting Aβ1－42 into the hippocampus；In the first 1－21 day，uric acid group 1，2，3 and 4 were intraperitoneally injected with 1、5、10、20 mg／（kg·d）uric acid，respectively.The blank control group and AD group were intraperitoneally injected with equal dose of saline.All animals were evaluated using Morris water-maze test.Malondialdehyde （MDA） content in＿the hippocampus was measured by using MDA reagent box and Caspase-3-positive neurons in the hippocampus were identified by using immunohistochemistry.Results Compared with the blank control group，the learning-memory ability was significantly declined and MDA content and the expression of Caspase-3-positive cell in the hippocampus was significantly increased at AD group， uric acid group 1，2，3 and 4（P＜0.01）.The improvements in learning-memory，the reduced MDA content and the less caspase-3 expression were observed in rats treated with two doses of uric acid （P＜0.01）.Conclusions Appropriate doses of uric acid can improve the learning-memory ability by reducing the oxidative stress and inhibiting the expression of caspase-3 in the hippocampus in the rat model of Alzheimer disease.

Eyk uric acid Alzheimer disease Learning-memory Malondialdehyde Caspase-3

R742

A

2011－12－10）

（責任編輯：李 立）

* 河南省南陽市第二人民醫院神經內科 （南陽 473012）

（E-mail：1136811893＠qq.com）

△ 河南省人民醫院神經內科 （鄭州 450014）