腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區TLR9信號通路的活化☆

謝芬方建業潘經銳黃小雄王藝東

·論 著·

腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區TLR9信號通路的活化☆

謝芬*方建業*潘經銳*黃小雄*王藝東*

目的 觀察大鼠腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區皮層Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）信號通路的活化情況。方法 制備Sprague-Dawley（SD）大鼠短暫大腦中動脈閉塞模型，缺血90 min后再灌注，隨機分兩組：6 h組（n＝5）和3 d組（n＝5），分別采用RT-PCR、Western-blot法測定梗死灶邊緣區皮層TLR9、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、干擾素調節因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）、干擾素－β（interferon-beta，IFN-β）的mRNA及蛋白表達。結果 6 h和3 d組TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表達量分別為（0.43±0.03）和（0.93±0.03）、（1.21±0.11）和（2.26±0.16）、（0.44±0.04）和（1.27±0.17）、（0.15 ±0.02）和（0.26±0.03），蛋白表達量分別為（0.75±0.04）和（1.35±0.04）、（0.93±0.04）和（1.05±0.02）、（0.54 ±0.03）和（0.73±0.02）、（0.82±0.02）和（0.93±0.03）（組間比較，均P＜0.01）。同組內TNF-α的表達明顯高于IFN-β的表達（均P＜0.01）。結論 TLR9信號通路在腦梗死早期的炎癥反應中可能起重要作用。

Toll樣受體9 腦缺血再灌注 大鼠

炎癥反應在腦缺血損傷的病理機制中起著重要的作用，早期造成組織損傷，而后期可能具有內源性修復作用［1］。炎癥反應的這種“雙刃劍”作用的機制是什么還不清楚。近年研究發現，先天免疫系統的重要組成部分——Toll樣受體 （Toll-like receptors，TLRs）介導了缺血性損傷［2］，其中一個重要作用就是參與炎癥反應。TLR9是Toll樣受體家族的重要成員，定位在細胞內的內涵體膜上，在中樞神經系統中TLR9主要表達于小膠質細胞。它不僅可以被來自病原體的配體激活，而且能被組織損傷后產生的DNA片段激活。TLR9擁有兩條不同的信號傳導通路，分別經過轉錄因子NFκB（nuclear factor kappa B）或IRF7途徑，誘導促炎因子TNF-α或神經保護分子IFN-β的產生。這兩條通路在腦缺血后不同階段如何發揮作用還沒有研究報道。本研究擬觀察大鼠腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區皮層TLR9信號通路的活化情況，初步探討TLR9信號通路在腦缺血損傷中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選擇清潔級健康成年雄性的SD大鼠 20只，體質量 280～330 g（由中山大學北校區實驗動物中心提供，合格證號：NO.0052811），按隨機數字表法分為模型組（即手術組）和假手術組，每組10只。手術組按再灌注時間點和腦組織取材來源再分為：6 h缺血側（I 1）、6 h缺血對側（C 1）、3 d缺血側（I 2）、3 d缺血對側（C 2）四個亞組。I 1和I 2在梗死灶邊緣區頂葉皮層取材，C 1和C 2則在大腦對側相應皮層取材。相同再灌注時間點的缺血側與缺血對側的腦組織取材于同一大鼠，6 h和3 d各5只。假手術組再分為6 h（S 1）和3 d（S 2）兩個亞組，各5只，取材部位與I 1、I 2一致。

1.2 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 參照改良Longa氏線栓法［3］制備右側大腦中動脈閉塞模型，在阻塞大腦中動脈90 min時將栓線拔出至頸外動脈內實現再灌注。大鼠清醒后出現左上肢癱瘓、轉圈、追尾征等為成功模型。假手術組不插入線栓，其余操作同手術組。術中及大鼠蘇醒過程肛溫保持在37℃。

1.3 反轉錄酶－聚合酶鏈式反應 （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）上述取材的腦組織約100 mg，采用Trizol一步法提取總RNA。采用Primer5引物設計軟件設計引物（引物序列見表 1）。RT擴增條件：30℃ 10 min，42℃30 min，94℃5 min；PCR擴增條件：94℃預變性1 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復變性、退火、延伸共35個循環，72℃，10 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳分離。利用Quantity One（ver 4.6.2）對所得的電泳圖像作分析。比較目標條帶與內參的光密度比值。

表1 PCR引物序列

1.4 Western-Blot 按常規方法提取腦組織總蛋白，SDS-PAGE方法電泳（條件：濃縮膠60 V，45 min，分離膠100 V，120 min），濕法轉膜（轉膜條件：100 V，100 min），封閉后加入一抗稀釋液（TLR9：1∶670，TNF-α：1∶500，IFN-β：1∶250，IRF7：1∶200）過夜孵育約12～16 h后，再用HRP-羊抗大鼠單抗進行二抗孵育。特異性的反應條帶通過化學發光系統顯色。結果由BIO-RAD圖像分析儀分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0對所得數據進行統計學處理。所有計量資料的比較采用t檢驗分析，結果用±s表示，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 RT-PCR 腦缺血再灌注6 h和3 d大鼠梗死灶邊緣區頂葉皮層均檢測到TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表達，其相對表達量隨時間延長而明顯增加（均P＜0.01）。在梗死灶邊緣區相應的對側皮層，除TNF-α mRNA外，TLR9、IRF7、IFN-β的mRNA均未檢測到，但TNF-α mRNA的表達未隨時間的延長而增加（P＝0.451）。在同一時間點，TNF-α mRNA在梗死灶邊緣區皮層的表達比對側相應皮層的表達更高（均P＜0.01）。同一時間點比較，梗死灶邊緣區皮層TNF-α mRNA的表達明顯高于IFN-β mRNA的表達（均P＜0.01）。在假手術組，以上4個因子的mRNA均未見表達。結果見圖1、表2。

2.2 Western-Blot 腦缺血再灌注6 h和3 d大鼠腦梗死灶邊緣區頂葉皮層均檢測到TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β蛋白的表達，其相對表達量隨時間延長而明顯增加（均P＜0.01）。在梗死灶邊緣區相應的對側皮層，除蛋白TNF-α外，蛋白TLR9、IRF7、IFN-β均未檢測到，但蛋白TNF-α的表達未隨時間的延長而增加；假手術組均未見上述蛋白的表達。同一時間點比較，梗死灶邊緣區和對側皮層的TNF-α蛋白表達均明顯高于IFN-β蛋白表達（均P＜0.05）。結果見圖2、表3。

3 討論

TLRs是先天免疫系統的重要組成部分，在先天性和獲得性免疫反應的啟動中起著重要作用。TLRs的一個重要作用就是介導炎癥反應，與中樞神經系統疾病密切相關的TLRs主要是TLR2、TLR4和TLR9。既往研究已證實TLR2和TLR4在腦缺血損傷中發揮作用［4］。而TLR9如何起作用還不清楚。TLR9信號通路具有TLR9-NFκB-TNF-α和TLR9-IRF7-IFN-β兩條不同的信號傳導通路。本實驗利用腦缺血再灌注的大鼠模型，觀察到腦缺血再灌注早期（6 h、3 d）TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA和蛋白表達水平在缺血側皮層均有明顯升高，而且隨時間的延長增加更加明顯。表明腦缺血再灌注后TLR9的兩條信號通路均被激活，而且隨時間延長表達增加。

本研究還發現，腦缺血再灌注6 h和3 d，TNF-α的表達量明顯高于IFN-β，提示TLR9-NFκB-TNF-α通路的激活較 TLR9-IRF7-IFN-β通路的激活更強，這與腦缺血再灌注早期炎癥反應造成組織損傷的研究結果一致。既往研究顯示，TNF-α是急性腦缺血損傷后重要的炎癥因子。TNF-α能刺激組織因子和白細胞粘附分子的表達，促進白細胞介素－1、一氧化氮、血管性血友病第八因子、血小板激活因子和內皮素的釋放，抑制凝血酶調節素－蛋白C－蛋白S系統的活性，減少組織纖溶酶原激活物的產生，從而減少纖溶酶原激活物抑制劑－1的釋放。TNF-α還能通過誘導黃嘌呤氧化酶，環氧合酶和煙酰胺腺嘌呤磷酸氫二核苷酸氧化酶以及其他相關的酶活性刺激內皮細胞產生活性氧化物。以上這些效應刺激局部腦血管，使局部腦血管易于形成炎癥、血栓和發生出血，從而促進缺血性腦卒中的發生和進展［5－6］。近年研究發現，IFN-β不僅具有抗病毒效應，在抗炎癥方面也發揮積極的作用。在細胞水平，IFN-β被證明能減少活性氧化物［7］，抑制炎癥細胞因子產物和誘導由星形膠質細胞產生的促神經生長因子產物——白細胞介素－1受體拮抗劑［8］。本實驗觀察到，隨著時間的延長，IFN-β在缺血組織中的表達呈現增高的趨勢，因此推測，IFN-β可能在腦缺血再灌注后期發揮作用，值得進一步研究。

圖1 大鼠頂葉皮層TLR9，TNF-α，IRF7和IFN-β的mRNA表達。其中I 1、I 2、C 1、C 2、S 1、S 2分別代表：6 h缺血側，3 d缺血側，6 h缺血對側，3 d缺血對側，假手術6 h，假手術3 d

圖2 大鼠頂葉皮層TLR9，TNF-α，IRF7和IFN-β的蛋白表達

表2 大鼠頂葉皮層TLR9信號分子mRNA表達

表3 大鼠頂葉皮層TLR9信號分子蛋白表達

本實驗在缺血對側的皮層中，TNF-α mRNA和蛋白均有表達，但沒有隨時間的變化而變化，表達量也明顯少于缺血側。Sairanen等［9］的研究也發現，梗死灶中心和邊緣區TNF-α的表達升高，而在對側腦組織和其他遠隔部位也能觀察到TNF-α的表達，但表達的量要低于梗死側。本實驗在缺血對側的皮層中，未觀察到TLR9、IRF7、IFN-β mRNA和蛋白的表達，說明缺血對側的TNF-α表達可能與TLR9的激活無關，是什么原因所致，還需要進一步研究來證實。

綜上所述，本研究觀察到，在腦缺血再灌注早期，TLR9的兩條信號通路均被激活，分別產生了促炎因子TNF-α和神經保護分子IFN-β，而TNF-α的表達明顯強于IFN-β。提示TLR9信號通路在腦梗死早期的炎癥反應中可能起重要作用。

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The activation of TLR9 signaling pathway in the peri-infarct cortex at the early stage of cerebral ischemiareperfusion.

XIE Fen，FANG Jianye，PAN Jingrui，HUANG Xiaoxiong，WANG Yidong.Department of Neurology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.Tel：020－81332619.

Objective To study the activation of toll-like receptor 9（TLR9）signaling pathway in the peri-infarct cortex at the early stage of ischemia-reperfusion in a rat model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）.Methods The MCAO model was induced in male rats by using intraluminal filament technique and reperfusion was performed by removing the filament at 90 minutes after occlusion.The MCAO rats were randomly assigned to 2 groups：6 h group（n＝5）and 3d group（n＝5）.RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of TLR9， TNF-α， IRF7 and IFN-β in the peri-infarct cortex.Results The mRNA and protein expression of TLR9，TNF-α，IRF7 and IFN-β were significantly higher in the 3 d group than in the 6 h group（mRNA：0.93±0.03 vs.0.43 ±0.03 on TLR9，2.26±0.16 vs.1.21±0.11 on TNF-α，1.27±0.17 vs.0.44±0.04 on IRF7，0.26±0.03 vs.0.15± 0.02 on IFN-β；protein：1.35±0.04 vs.0.75±0.04 on TLR9，1.05±0.02 vs.0.93±0.04 on TNF-α，0.73±0.02 vs.0.54±0.03 on IRF7，0.93±0.03 vs.0.82±0.02 on IFN-β；P＜0.01）.The mRNA and protein expression of TNF-α were significantly higher than IFN-β in the peri-infarct cortex at all time points（P＜0.01）.Conclusions TLR9 signaling pathway may play a critical role in the inflammatory response at the early stage of cerebral infarction.

Toll-like receptor 9 Cerebral ischemia-reperfusion Rat

R741

A

2011－05－06）

（責任編輯：李 立）

☆ 國家自然科學基金（編號：81171103），廣東省自然科學基金（編號：9151008901000028，S2011010006043）

* 中山大學孫逸仙紀念醫院神經科（廣州 510120）

（E-mail：wydys＠yahoo.com.cn）