昆明地區漢族人vWF基因多態性與急性腦梗死的相關性

劉江翟明張蕾董曼麗張芹趙忠

·論 著·

昆明地區漢族人vWF基因多態性與急性腦梗死的相關性

劉江*翟明*張蕾*董曼麗*張芹*趙忠*

目的 探討血漿血管性假性血友病因子（von Willebrand factor vWF）表達水平及其基因19內含子MspI（Major surface protease I）多態性與急性腦梗死的相關性。闡明vWF基因19內含子MspI多態性在昆明地區漢族人群中的分布。方法 收集119例急性腦梗死（24 h內）和117名昆明地區漢族健康人為對照，免疫比濁法檢測血漿vWF表達水平；聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性結合MspI酶切技術進行vWF基因19內含子MspI多態性分析。結果 急性腦梗死血漿vWF表達水平為（189.37% ±89.55%）明顯高于對照組（P＜0.05）。昆明地區漢族人群中vWF基因19內含子 MspⅠM＋／M＋、M＋／M－和 M－／M－基因型頻率分布分別為 0.047、0.377和0.576；M＋／M－等位基因型頻率分布分別為0.235、0.765。腦梗死組MspⅠ多態性M－／M－基因型頻率高于對照組（P＜0.05）。腦梗死組M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型的循環vWF水平分別為（170.00%±78.67%）、（148.62%±62.58%）和（205.38%±92.68%），各基因型之間差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 血漿vWF表達水平及vWF基因19內含子MspⅠ多態性M－／M－基因型與急性腦梗死發生有顯著相關性；昆明地區漢族人群中vWF基因19內含子MspⅠ等位基因M＋和M－的分布與其他人群不同。

急性腦梗死 血管性假性血友病因子 基因多態性 MspI酶切位點

在腦梗死的發生中血小板起了促進血栓形成的作用，尤其是血小板的受體與配體對于血小板黏附與聚集功能起到重要調控作用。血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）受體在血栓形成中調節血小板，是缺血性腦卒中的候選基因。當血管內皮細胞受損時，血小板膜糖蛋白（GP）的配體血管性假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）的合成增加并大量釋放入血，是目前最具有特征性的血小板活化的分子標志物，可敏感地反映血小板活化程度［1－2］。本研究對昆明地區漢族健康正常人群及急性腦梗死患者血漿vWF表達水平及其基因19內含子MspI多態性進行分析，探討與急性腦梗死的相關性及vWF基因19內含子MspI基因多態性在昆明地區漢族人群中的分布。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組選取2007年1月至2009年9月我科就診的急性腦梗死患者（起病24 h內）籍貫為昆明的漢族人119例，其中男56例，女63例；年齡為42～83歲，平均（64.9±13.4）歲。對照組：籍貫為昆明地區漢族健康體檢者117名，其中男51名，女66名；年齡為39～84歲，平均（62.4± 11.3）歲。病例組和正常對照組年齡、性別具有可比性均無統計學差異。

1.2 病例組入選標準 急性腦梗死診斷標準符合中華醫學會第四次腦血管病學會議修訂的診斷標準［3］，經臨床、頭部CT和／或MRI檢查確診，發病24小時內。

1.3 病例組排除標準 ①潛在的心源性栓子 （包括3周內新發心肌梗塞、房顫、二尖瓣狹窄或機械瓣、擴張型心肌病、病態竇房結綜合征及細菌性心內膜炎）；②周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者、大動脈炎、外傷、手術、藥物、惡心腫瘤、血管畸形或動脈瘤等引起的腦梗死；③無癥狀性腦梗死；④患有嚴重肝腎疾病、感染、甲狀腺疾病、凝血功能障礙、血液病；⑤高血脂；⑥抽血前2周內用過阿司匹林、潘生丁、肝素等影響血小板的藥物。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 病例組入院當天用抗凝管采靜脈血2.7 mL，血與抗凝劑（0.109 mol／L枸櫞酸鈉）容積比為 9∶1，室溫條件下 2500 r／min離心 10 min，小心取出上層血漿－20℃保存，統一測定vWF。對照組在體檢時用同樣的方法采血。

1.2.2 檢測方法 采用法國STAGO公司產全自動血凝儀，免疫比濁法測定。試劑為STA-LIATEST vWF（法國STA公司配套試劑）；用STA-vWF Ag CALIBRATOR進行定標，STA-Liatest Control N＋P完成質控后將標本上機檢測。

1.2.3 DNA提取 取空腹靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝。按離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作，采用熱啟動PCR擴增vWF基因19內含子MspI特異片段，引物設計參考文獻資料［4－5］。上游引物：5′-AGGGCTAGATCA GTCACTGTGGCCCT-3′；下游引物為：5′-TGGC CGCGAGCTCCCTCACTCCACC-3′。MspI酶切位點：61CCGGCATGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAA GGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCAAGGA121GTAT GCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACA CTTGGTGAGGCTCAGTGAGGGG，切開部位為C／CGG；研究多態性區域為181CTGCGCCGGGGACC CAGGCCCTGCGTGGCCGCGAGCTCCCTCACTCCAC C。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0進行統計學分析，數據均采用±s差表示，對各組血漿vW值進行單因素方差分析（One-Way ANVOA），組間比較采用Scheffe檢驗（方差具有齊性）和Tamhane’s T2檢驗（方差不齊時）。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 血漿vWF表達水平 腦梗死組血漿vWF表達水平（189.37%±89.55%）升高較對照組（84.33% ±33.56%）明顯，差異有統計學意義（t＝11.93，P＝0.000）。

2.2 vWF基因19內含子MspI多態性基因型總體頻率分布 昆明地區漢族人群中vWF基因19內含子MspI多態性M＋／M＋、M＋／M－、M－／M－、M＋和M－基因型總體頻率分布分別為0.047、0.377、0.576、0.235、0.765。腦梗死組中M＋／M＋、M＋／M－和 M－／M－基因型頻率分別為 0.059、0.286和0.655；M＋／M－等位基因頻率分別為0.202、0.798。對照組中M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－基因型頻率分別為0.034、0.470和0.496；M＋和M－等位基因頻率分別為0.269、0.731（表1）。

表1 昆明地區腦梗死組與對照組vWF基因19內含子MspI多態性基因型和等位基因頻率

表2 病例組與對照組vWF基因19內含子MspI酶切位點基因型及等位基因頻數比較

腦梗死組的vWF基因19內含子MspⅠ多態性M＋／M－和M－／M－基因型頻率與對照組相比較差異有統計學意義 （P均＜0.05），其M－／M－型頻率均高于對照組，M＋／M－基因型頻率均低于對照組，M＋／M＋、M＋和 M－等位基因頻率在兩組間比較差異無統計學意義 （P均 ＞0.05）（表2）。

2.3 vWF基因19內含子MspI等位基因型MspI＋／MspI-的分布 我國漢族人群vWF基因19內含子MspI等位基因型MspI＋／MspI-的分布頻率為0.20∶0.80、彝族人為0.26∶0.74、傣族人為0.17∶0.83［5］、高加索白種人為0.33∶0.67［6］。昆明地區漢族人MspI＋／MspI-的分布頻率為0.235∶0.765，各等位基因型的分布與國內其他地區人群有一定差異，與白種人群差異較大（表3）。

2.4 vWF基因多態性分布的Hardy-Weinberg檢驗 應用Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗方法，把觀察值與預期值作比較，進行χ2檢驗。病例組、對照組及總體人群的基因型分布的觀察值和預期值差異無統計學意義（P＞0.05），表明它們的基因型頻率分布沒有偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明我們所選擇的研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布（表4）。

2.5 vWF基因19內含子MspI多態性基因型和血漿vWF表達水平變化的關系 行單因素方差分析分別比較腦梗死組與對照組三種基因型組間vWF表達水平，腦梗死組M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型的循環vWF表達水平分別為（170.00%±78.67%）、（148.62%±62.58%）和（205.38%±92.68%），各基因型血漿vWF表達水平之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型血漿vWF表達水平分別為（82.00%±24.39%）、（90.77%±30.84%）和（85.19%±33.62%）各基因型血漿vWF表達水平之間比較無統計學意義（P＞0.05）（表5）。

表3 不同地域、不同種族間vWF基因19內含子MspI酶切位點等位基因型分布

表4 vWF基因MspI酶切位點基因型多態性分布Hardy-Weinberg檢驗

表5 vWF基因19內含子MspI多態性與vWF表達水平的關系

表6 腦梗死組vWF基因19內含子MspI多態性與vWF表達水平的關系

表7 腦梗死的危險因素

兩兩比較結果顯示病例組vWF基因19內含子MspI M＋／M－和M－／M－基因型血漿vWF表達水平比較差異顯著有統計學意義（P＜0.01）；M＋／M＋和M＋／M－基因型、M＋／M＋和M－／M－基因型血漿vWF表達水平比較差異無統計學意義 （P＞0.05）（表6）。

2.6 影響急性缺血性腦梗死發生的危險因素將急性腦梗死的發生作因變量，以擬選定的，高血壓病病史、vWF血漿含量和M－／M－作為自變量，采用非條件Logistic回歸分析影響腦梗死的發生的危險因素。Logistic回歸分析結果高血壓病病史、vWF血漿含量 和M－／M－，3個變量與急性腦梗死的發生有關。并且偏回歸系數均為正值，Exp（β）大于 1，說明高血壓病病史、vWF血漿含量和M－／M－基因型是急性腦梗死發生的危險因素（表7）。

3 討論

vWF是血管內皮細胞和骨髓巨核細胞合成的一種大分子糖蛋白。當內皮細胞受到損傷時，vWF能夠從內皮細胞的韋伯一潘拉迪小體分泌到血漿或血管內皮下。通過血小板膜糖蛋白IB2X介導血小板與內皮下膠質的黏附，成為血小板與內皮下成分黏附的橋梁。內皮受損vWF大量釋放入血，介導血小板黏附聚集于受損的血管內皮下啟動凝血導致血栓形成［7－8］。血栓形成病理過程中，血管內皮細胞損傷，血小板活化起關鍵的作用。vWF是目前公認的內皮細胞標記物，僅在成熟的內皮細胞上存在，它可以反映內皮細胞的功能狀態。血漿高水平的vWF常伴隨著發生血栓形成疾病的危險，對高血壓病人、冠心病、腦梗死的發病有預測價值［9－10］。Jansson等［11］研究表明在心肌梗塞幸存者中，vWF表達水平增高與再發梗塞或心源性死亡的危險性增加有關。本研究入組病例時排外心源性及外周血管病，選取大動脈硬化性腦梗塞。結果顯示血漿vWF表達水平在急性腦梗死后24小時內明顯升高，說明急性大動脈硬化性腦梗死患者此指標表達活躍，參與急性腦梗死的病理過程。進行Logistic多元回歸分析，發現血漿vWF水平表達增高和高血壓是急性缺血性腦梗死發生的危險因素，進一步證明vWF在腦梗死發生中起關鍵作用。vWF指標測定對大動脈硬化性腦梗死的早期診斷及治療具有重要意義，為急性腦梗死患者早期溶栓及抗血小板治療提供依據，對觀察病情演變及判斷預后均有重要的臨床價值。

有資料顯示vWF基因19內含子Mspl酶切位點多態性可能是冠心病的一個遺傳標志，其M＋／M－基因型可能是引起冠心病包括心肌梗死和心絞痛的一個危險因素。提示M＋／M－基因型在冠心病的發生、發展中所發揮的作用可能與循環vWF水平有關［12］。Mercier［6］研究發現高加索人中，在vWF基因第19號外顯子的3′端存在MspI的多態性位點。MspI＋／MspI－的頻率為0.33∶0.67。李震宇等［5］研究發現在我國漢族人群，同樣存在該位點的多態現象，但發生頻率低于高加索人，在我國漢族人中 MspI＋／MspI－的頻率為 0.20∶0.80；彝族人為0.26∶0.74、傣族人為0.17∶0.83。本研究結果M＋與M－等位基因的發生頻率為0.264∶0.736；各等位基因型的分布與國內其它地區人群有一定差異，與白種人群差異較大。這種差異可能是由于地域和種族不同，環境與基因相互作用的結果，我國漢族人種與國外人種存在較大差異，中國人群高血壓、腦梗死的發病率均高于西方人群，而血脂水平卻普遍低于西方人群。云南省屬于高海拔地區，昆明位于云南省中部平均海拔為1894米左右，地理環境較特殊。本研究vWF基因多態性分布的Hardy-Weinberg檢驗，病例組、對照組及總體人群的基因型分布的觀察值和預期值差異無顯著性 （P＞0.05），說明我們所選擇的研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。因此19內含子Mspl酶切位點多態性檢驗在vWF的基因診斷中有一定的價值。為進一步有效篩選腦梗死的候選基因，需要更多的大樣本的臨床研究和開展遺傳流行病學、分子流行病學研究及綜合考慮多因素，對基因－基因及基因－環境相互作用進行深入研究。

目前關于vWF基因19內含子MspI多態性與腦梗死的相關性研究的較少。本研究結果腦梗死組vWF基因19內含子MspI多態性基因型M＋／M＋、M＋／M－和M－／M－型的循環vWF表達 水平分別為 （170.00±78.67）%、（148.62±62.58）%和（205.38±92.68）%各基因型血漿vWF表達水平之間比較差異有統計學意義（P＜0.01），M－／M－型頻率均高于對照組（P＜0.01）。Logistic回歸分析證實MspⅠ酶切位點多態性M－／M－基因型是急性腦梗死發生的危險因素之一。vWF基因MspⅠ酶切位點多態性可能是通過升高vWF水平在急性腦梗死的發生中發揮作用。其究竟通過何種機制影響循環vWF水平，是在剪接水平上，抑或與其他基因多態性連鎖，尚需進一步深入研究。

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Relationship of vWF gene MspI polymorphism with acute cerebral infarction in Han Chinese in Kunming.

LIU Jiang，ZHAI Ming，ZHANG Lei，DONG Manli，ZHANG Qin，ZHAO Zhong.Department of Neurology，The first people’s Hospital of Yunnan province，Kunming 650032，China.No.157，JinBi Road，Kunming city.Tel：0871－3638677.

Objective To explore the correlation of vWF（von Willebrand factor）plasma levels and its gene intron 19 MspI（major surface protease I） restriction site polymorphism with the attack of acute acute cerebral infarction and to investigate allele distribution frequencies of the vWF gene intron 19 MspI restriction site in Han Chinese in Kunming.Methods One hundred nineteen patients with acute cerebral infarction（24 h）patients and 117 cases of healthy people in Han Chinese Kunming controls were recruited in the present study.Plasma vWF level were determined by immune turbidimetry and vWF gene MspI polymorphism in intron 19 was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism with MspI restriction enzyme digestion.Results Plasma vWF level（189.37%±89.55%）was significantly higher in acute cerebral infarction group than in control group（P＜0.05）.The M＋／M＋，M＋／M－and M－／M－genotype frequencies of vWF gene intron 19 and MspⅠrestriction sites were 0.047， 0.377 and 0.576 and M＋／M-allele frequencies were 0.235：0.765.MspⅠM－／M-genotype frequency was significantly higher in cerebral infarction group than in normal control group（P＜0.05）.In patient group，plasma vWF levels were 170.00%±78.67%in M＋／M＋， 148.62%±62.58%in M＋／M－and 205.38%±92.68%in M－／M－and the vWF levels were significantly different among those different genotypes（P＜0.05）.Conclusion Plasma vWF levels，MspⅠpolymorphism in intron 19 and M－／M-genotype are significantly correlated with acute cerebral infarction and the distribution of vWF gene intron 19 and the distribution of MspⅠM＋and M-allele in Han Chinese Kunming are different with other populations.

Acute cerebral Infarction von Willebrand Factor gene Polymorphism MspI restriction site

R743.3

A

2011－01－26）

（責任編輯：李 立）

* 云南省第一人民醫院神經內科 （昆明650032）

（E-mail：zhaiming68＠126.com）