皮膚源祖細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面神經(jīng)的修復(fù)☆

黃勇祁少海舒斌毛任翔謝舉臨徐盈斌劉旭盛

·論 著·

皮膚源祖細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面神經(jīng)的修復(fù)☆

黃勇*祁少海△舒斌△毛任翔△謝舉臨△徐盈斌△劉旭盛△

目的 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究皮膚源祖細(xì)胞對(duì)皮膚創(chuàng)面神經(jīng)修復(fù)的影響。方法 分離、培養(yǎng)昆明鼠皮膚源祖細(xì)胞，并用CM－DiI進(jìn)行標(biāo)記。將30只昆明鼠隨機(jī)分為細(xì)胞移植組，單純培養(yǎng)基組和空白組，通過尾靜脈注射觀察細(xì)胞在體內(nèi)的遷移，檢測(cè)創(chuàng)面的愈合率和PGP9.5的表達(dá)。結(jié)果 皮膚源祖細(xì)胞表達(dá)Fibronectin和Nestin；傷后第1、2周，皮膚源祖細(xì)胞逐漸遷移至皮膚全層，并在皮膚毛囊處亦可見；細(xì)胞移植組的創(chuàng)面愈合率分別為31.08%±1.74%，64.20%±1.45%明顯高于單純培養(yǎng)基組和空白組（23.85%±1.59%，49.81%±2.10%；22.63% ±1.02%，49.51%±1.10%）；細(xì)胞移植組PGP9.5熒光密度（11.60±1.67，16.60±1.14）明顯高于單純培養(yǎng)基組和空白組（P＜0.05）。結(jié)論 皮膚源祖細(xì)胞參與了創(chuàng)面愈合，同時(shí)促進(jìn)了創(chuàng)面處的神經(jīng)再生，有利于創(chuàng)面神經(jīng)修復(fù)，可能成為修復(fù)神經(jīng)損傷的種子細(xì)胞。

神經(jīng)再生 創(chuàng)面 干細(xì)胞

機(jī)體組織的創(chuàng)傷或缺血往往伴隨著神經(jīng)的損傷。神經(jīng)再生與創(chuàng)面修復(fù)同步進(jìn)行，并在修復(fù)過程中起著重要作用。截癱與糖尿病患者由于存在神經(jīng)營養(yǎng)障礙，常常導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈［1］。不僅如此，創(chuàng)面愈合后，由于缺乏皮下神經(jīng)、神經(jīng)末梢，患者常存在感覺過敏（如瘙癢），感覺遲鈍等癥狀，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量［2］。近年來，應(yīng)用干細(xì)胞修復(fù)周圍神經(jīng)損傷逐漸受到關(guān)注［3－4］。本實(shí)驗(yàn)中，通過制備鼠皮膚創(chuàng)面模型，觀察靜脈注射皮膚源祖細(xì)胞（skin-derived percursors，SKPs）體內(nèi)遷移，及其對(duì)皮膚神經(jīng)再生修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，出生1～3 d的SPF級(jí)昆明小鼠，及4～6周齡雄性昆明小鼠30只，購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量25～30 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 SKPs的培養(yǎng)、鑒定與標(biāo)記 鼠SKPs的分離培養(yǎng)、鑒定見文獻(xiàn)［5］，并將第三代細(xì)胞置于含2%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

取第三代皮膚源祖細(xì)胞，胰酶消化2 min，含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打、將細(xì)胞球團(tuán)分離成單個(gè)細(xì)胞。以2 μg／mL CM-DiI標(biāo)記液（美國Molecular Probes公司）37℃孵育5 min，再置入4℃冰箱孵育15 min，1500轉(zhuǎn)／min離心5 min，棄去上清液，PBS漂洗3次，完成標(biāo)記。用新鮮培養(yǎng)基（不含生長因子和血清）重懸，定容至細(xì)胞濃度為1×107～2.5×107個(gè)／mL，避光備用。

1.3 模型制作和分組 30只4～6周齡雄性昆明小鼠隨機(jī)分為3組，細(xì)胞移植組，單純培養(yǎng)基組和空白組。以10%水合氯醛（0.1 mL／20 g）腹腔注射麻醉，動(dòng)物脫毛劑脫毛，背部制作1個(gè)直徑大小為1.0 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。細(xì)胞移植組尾靜脈注射CM-DiI標(biāo)記的細(xì)胞，單純培養(yǎng)基組尾靜脈注射新鮮培養(yǎng)基，空白組為僅為創(chuàng)面。創(chuàng)面覆蓋凡士林油紗、包扎、單籠飼養(yǎng)。分別于移植細(xì)胞后第1、2、4周處死小鼠，取全層創(chuàng)面標(biāo)本均置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 計(jì)算創(chuàng)面愈合率 制創(chuàng)后記錄創(chuàng)面面積為原始創(chuàng)面面積，于取材時(shí)拓模記錄各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積為未愈創(chuàng)面面積。創(chuàng)面收縮率＝（原始創(chuàng)面面積－未愈創(chuàng)面面積）／原始創(chuàng)面面積×100%，采用Image-Pro Plus 6.0軟件 （美國Media Cybernetics公司）進(jìn)行計(jì)算。

1.5 SKPs的遷移和免疫組織化學(xué) 以8 μm厚度冰凍切片，避光保存。觀察前滴加DAPI（Sigma公司）染核，室溫下孵育10 min，PBS漂洗10 min×3次，在熒光顯微鏡下觀察SKPs在皮膚的遷移情況。

采用生物素標(biāo)記的免疫熒光試劑盒檢測(cè)表皮下及真皮層Protein Gene Production 9.5（PGP 9.5，abcam公司）的表達(dá)［2］，以此反映皮膚神經(jīng)再生情況。每個(gè)標(biāo)本PGP 9.5熒光密度的評(píng)估方法為：每張切片在低倍鏡下（10×10）找出表皮下及真皮層PGP 9.5高表達(dá)區(qū)，然后在高倍鏡下（10×40）隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算熒光光點(diǎn)個(gè)數(shù)，均數(shù)為該張切片表皮下及真皮層PGP 9.5熒光密度值。每個(gè)標(biāo)本觀察10張切片，均數(shù)為該標(biāo)本表皮下及真皮層PGP 9.5熒光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，單因素方差分析、方差齊性檢驗(yàn)及樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 SKPs的體外培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，少部分細(xì)胞呈懸浮生長，其他細(xì)胞貼壁并逐漸死亡，懸浮細(xì)胞生長速度增快，形成克隆球團(tuán)。克隆球團(tuán)逐漸增大，一般含30～50個(gè)細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)巢蛋白、纖維連接蛋白。將第三代皮膚源祖細(xì)胞置于含2%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，克隆球團(tuán)逐漸貼壁，部分細(xì)胞胞體伸出長突起，呈雙極、多極及錐形，類似神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)；部分細(xì)胞胞內(nèi)可見透亮圓形脂滴（圖1）。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) SKPs表達(dá) Fibronectin和Nestin。

圖1 A：第三代皮膚源祖細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，倒置顯微鏡（100×）；B：在含有2%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，克隆球團(tuán)貼壁，倒置顯微鏡（100×）；C：培養(yǎng)10 d后，部分細(xì)胞似神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，倒置顯微鏡（100×）；D：培養(yǎng)10 d后，部分細(xì)胞胞體內(nèi)有脂滴形成，倒置顯微鏡（100×）

表1 不同時(shí)間各組創(chuàng)面愈合率（%，±s）

表1 不同時(shí)間各組創(chuàng)面愈合率（%，±s）

1）與A組（細(xì)胞移植組）比較，單因素方差分析，P＜0.05

組別細(xì)胞移植組單純培養(yǎng)基組空白組1周2周31.08±1.74 23.85±1.591）22.63±1.021）64.20±1.45 49.81±2.101）49.51±1.101）

表2 不同時(shí)間各組PGP9.5表達(dá)（個(gè)，±s）

表2 不同時(shí)間各組PGP9.5表達(dá)（個(gè)，±s）

1）與A組（細(xì)胞移植組）比較，單因素方差分析，P＜0.05

組別細(xì)胞移植組單純培養(yǎng)基組空白組1周2周4周11.60±1.67 7.20±1.481）6.60±1.521）16.60±1.14 11.20±1.301）11.00±1.581）20.40±2.07 20.00±2.00 20.00±1.58

圖2 A：尾靜脈注射CM-DiI標(biāo)記的SKPs，傷后第2周，SKPs分布在皮膚全層，毛囊處亦可見（熒光顯微鏡200×）；B：細(xì)胞移植組中，傷后第1周PGP9.5的表達(dá)（熒光顯微鏡200×）

2.2 傷后創(chuàng)面愈合率 傷后1，2周，細(xì)胞移植組創(chuàng)面愈合率顯著高于單純培養(yǎng)基組、空白組 （P＜0.05）（表1）。

2.3 細(xì)胞遷移及體內(nèi)分化 在體外用CM-DiI標(biāo)記皮膚源祖細(xì)胞，其標(biāo)記率為100%。移植1周后，在背部創(chuàng)面處及其周邊部位可見到CM-DiI標(biāo)記皮膚源祖細(xì)胞，2周時(shí)細(xì)胞逐漸遷移至皮膚全層，在皮膚附屬器毛囊處亦可見（圖2A）。PGP9.5分布在表皮釘突及真皮層的毛囊鞘 （圖2B），各組PGP9.5的熒光密度見表2。傷后1，2周，細(xì)胞移植組PGP9.5的表達(dá)明顯高于單純培養(yǎng)基組、空白組（P＜0.05）。

3 討論

皮膚作為人體最大的器官，是一個(gè)極其敏感的神經(jīng)依賴性器官。因此，在其創(chuàng)傷修復(fù)調(diào)節(jié)過程中，神經(jīng)因素占有重要地位，而且創(chuàng)面微血管的再生也與神經(jīng)支配有關(guān)，血管與神經(jīng)的再生、發(fā)育是相輔相成的。周圍神經(jīng)的修復(fù)貫穿創(chuàng)面愈合的整個(gè)過程［6－7］。有學(xué)者認(rèn)為［2］，周圍神經(jīng)的修復(fù)一方面由健存的神經(jīng)軸突的延伸長入，另一方面可能由局部的干細(xì)胞增殖、分化而來，那么動(dòng)員干細(xì)胞向神經(jīng)組織分化，就有可能促進(jìn)創(chuàng)面的神經(jīng)再生修復(fù)，進(jìn)而有利于促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

皮膚源祖細(xì)胞在2010年在皮膚真皮層分離出，表達(dá)Nestin同神經(jīng)干細(xì)胞［3］，而且Toma等［8］發(fā)現(xiàn)皮膚源祖細(xì)胞在含10%FBS的培養(yǎng)基中可分化成神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本課題組在SKPs的培養(yǎng)過程中加入了 3-叔丁基-4-羥基茴香醚（BHA）和二甲基亞砜（DMSO），成功將細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞［5，9］，并且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SKPs參與了糖尿病鼠模型中的創(chuàng)面修復(fù)。但是在創(chuàng)面修復(fù)過程中，SKPs是否轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞參與了周圍神經(jīng)的修復(fù)尚未可知。

通過尾靜脈注射CM-DiI標(biāo)記的SKPs，可以在傷后第1，2周被觀察到遷移至創(chuàng)面處，并定位于表皮層與真皮層毛囊處。傷后第1，2周，細(xì)胞移植組的創(chuàng)面愈合率明顯高于其他兩組，因此再次實(shí)驗(yàn)證明了SKPs參與了創(chuàng)面修復(fù)。蛋白基因產(chǎn)物PGP9.5是一種神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)蛋白，已廣泛用于探索神經(jīng)再生以重新支配靶器官的標(biāo)記［10］。在實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞移植組可見在真皮毛囊鞘和表皮釘突處有PGP9.5表達(dá)，同相關(guān)研究結(jié)果相似［11］，表明SKPs在創(chuàng)面處各種損傷信號(hào)的刺激下向周圍神經(jīng)細(xì)胞分化，抑或分泌了促神經(jīng)再生的因子。

因此，在本實(shí)驗(yàn)中可以看出，皮膚源祖細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)相似，但較其易于獲得，分布廣泛，在體內(nèi)參與了創(chuàng)面的修復(fù)，其可能機(jī)制為除了直接參與表皮和真皮重建外，還可能參與了創(chuàng)面的神經(jīng)修復(fù)，進(jìn)而有利于促創(chuàng)面愈合信號(hào)的釋放，提示皮膚源祖細(xì)胞可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的種子細(xì)胞。

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（責(zé)任編輯：李 立）

In vivo study on the effect of Skin-derived precursors（SKPs） on neural repair in skin wounds.

HUANGYong，Qi Shao-hai，SHU Bin，MAO Ren-xiang，XIE Ju-lin，XU Ying-bin，LIU Xu-sheng Department of emergency and burns，the First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.Tel：020－87755766.

Objective To study the effect of Skin-derived precursors（SKPs）on neural repair in skin wounds in vivo.Methods SKPs were isolated，cultured and identified in vitro and were then labeled with CM-DiI.Thirty Kunming mice were divided into 3 groups randomly：cell transplantation，culture media and control groups.The labeled cells were injected to mice in cell transplantation group through vena caudalis.Cell migration，wound healing rate，and the expression of PGP9.5 were detected at 1，2，4 weeks post skin wound.Results Fibronectin and Nestin expression was detected in SKP2.At 1， 2 post wound weeks， SKPs gradually migrated to whole layer of skin including the papillae of hair and whisker follicles.The wound healing rates in cell transplantation group were 31.08%±1.74%and 64.20%±1.45%，which were higher than those in other groups（23.85%±1.59%，49.81%±2.10%；22.63%±1.02%，49.51%±1.10%），and the fluorescence densities of PGP9.5 were also higher in cell transplantation group than in other groups（P＜0.05）.Conclusions SKPs are involved in skin wound healing，and promote nerve regeneration，which may become the seed cells for repairing nerve damage.

Neural regeneration Wound Stem cell

R651.3

A

2011－03－14）

☆ 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2010B031100008）；創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家實(shí)驗(yàn)室開放基金（編號(hào)：SKLKF200808）；廣東省自然科學(xué)基金博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：8451008901000894）

* 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科（廣州 510080）

△ 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷外科

（E-mail：knowledgeslave＠yahoo.com.cn）