胱硫醚β合酶基因突變對(duì)中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病的影響☆

劉懷翔談曉牧劉建國張靜張哲成

·論 著·

胱硫醚β合酶基因突變對(duì)中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病的影響☆

劉懷翔*談曉牧△劉建國※張靜⊙張哲成⊙

目的 前瞻性研究觀察胱硫醚β合酶（cystathionine β synthase CBS）T833C基因突變對(duì)中青年腦梗死患者再發(fā)缺血性血管病（腦梗死、TIA、心肌梗死、其他血管栓塞）的影響。方法 分別采用高壓液相色譜法和擴(kuò)增阻滯突變體系法檢測(cè)152例中青年腦梗死患者和84例正常對(duì)照組的血漿總同型半胱氨酸 （total homocystine tHcy）水平和CBS T833C基因型，在5年內(nèi)對(duì)其隨訪追蹤再發(fā)缺血性血管病的情況。結(jié)果 CBS T833C基因C／C純合突變型、C／T雜合型和T／T野生型中青年腦梗死患者隨訪再發(fā)腦梗死的再發(fā)率C／C型（35.00%）依次高于C／T型（22.00%）和T／T型（13.41%）；各基因型隨訪發(fā)生TIA、心肌梗死和其它血管栓塞，趨勢(shì)是C／C型高于C／T和T／T型，C／T高于T／T型；不同基因型隨訪總的缺血性事件有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＜0.01），發(fā)生率分別為C／C型（60.00%）、C／T型（40.00%）和T／T型（23.17%）；Logistic回歸分析顯示tHcy水平升高是中青年腦梗塞再發(fā)缺血性血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR為1.110；95%CI：0.989～1.245，P＜0.05），而CBS T833C基因突變未進(jìn)入回歸模型。結(jié)論 血漿tHcy水平升高是中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CBS T833C基因突變引起tHcy水平升高，可能是間接導(dǎo)致中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病的易感基因。

胱硫醚β合酶 腦梗死 同型半胱氨酸 中青年 再發(fā)

Bos MJ等［1］研究已發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，Hhcy）是青年缺血性卒中或TIA復(fù)發(fā)血管事件的危險(xiǎn)因素，胱硫醚β合酶（cystathionine β synthase CBS）是同型半胱氨酸（homocystine，Hcy）在體內(nèi)代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，本研究結(jié)合目前同類研究現(xiàn)狀和不足，對(duì)中青年腦梗死患者進(jìn)行了tHcy水平及CBS基因型檢測(cè)，并對(duì)其在5年內(nèi)進(jìn)行再發(fā)缺血性血管事件的隨訪，以期為臨床防治中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病提供新的證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)1996年全國腦血管病會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，選取2000年至2003年住院的中青年腦梗死患者185例（隨訪152例，失訪33例），隨訪患者中，男113例，女39例，29～55歲，平均年齡（49.38±5.45），除外房顫和肝、腎、甲狀腺疾病及服用葉酸與B族維生素制劑的患者，于發(fā)病后5年內(nèi)對(duì)患者進(jìn)行跟蹤隨訪，以了解再發(fā)缺血性血管病的情況（隨訪方式包括門診、電話和信件聯(lián)系），隨訪期間均予以患者常規(guī)阿司匹林治療，高血壓、糖尿病、高血脂等均以藥物進(jìn)行控制干預(yù)。同期健康對(duì)照組90例（隨訪84例，失訪6例），隨訪對(duì)象中男59例，女25例，平均年齡（48.32±5.20）歲，既往身體健康，年齡、性別構(gòu)成、吸煙及飲酒狀況同病例組相匹配。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集與檢測(cè) 受試者（病例組均發(fā)病3 d內(nèi)）當(dāng)日晨空腹靜脈血8 mL，2 mL以5%EDTA抗凝，冰浴，1 h內(nèi)離心取血漿于－70℃冰箱保存，用于待測(cè)血漿tHcy水平，另外6 mL用于肝、腎功能、血脂等常規(guī)生化指標(biāo)檢查。使用Waters-600E高效液相色譜分析儀及 RF-10A熒光檢測(cè)儀和CR-1B色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)、Eorbax×C18（250 mm× 4.6 mm）分析柱進(jìn)行血漿tHcy測(cè)定；余生化指標(biāo)測(cè)定由TBA-120FR全自動(dòng)生化分析儀完成。

1.2.2 CBS基因型多態(tài)性檢測(cè) 采用擴(kuò)增阻滯突變體系法（PCR-ARMS）分析CBS T833C基因型，取肘正中靜脈血2 mL，5%EDTA抗凝。用TKM法提取基因組DNA，CBS擴(kuò)增引物序列參考文獻(xiàn)［3］，由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL，常規(guī)配制，擴(kuò)增CBS基因的反應(yīng)條件為：94℃變性5 min，94℃1 min，56℃1 min，72℃1 min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增片段大小為870 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，行t及q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；中青年腦梗死再發(fā)危險(xiǎn)因素采用逐步Logistic回歸分析方法處理。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組tHcy水平、Hhcy檢出率及一般情況病例組tHcy水平及Hhcy檢出率明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；病例組高血壓、糖尿病、冠心病、Glu、TC、TG、LDL和體重指數(shù)（BMI）均高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 CBS基因擴(kuò)增結(jié)果和基因型 CBS基因擴(kuò)增的目的片斷長(zhǎng)度為870 bp，分為純和突變型C／C、雜和型C／T及野生型T／T。見圖1。

2.3 兩組CBS基因型及其等位基因頻率分布 病例組CBS基因型及C等位基因頻率分布均高于對(duì)照組（P＜0.01）。見表2。

2.4 兩組CBS不同基因型tHcy水平比較 病例組CBS 3種基因型tHcy水平均高于對(duì)照組 （P＜0.01）；病例組中C／C型tHcy水平高于C／T和T／T型者 （P＜0.01），C／T型高于T／T型者 （P＜0.01）；對(duì)照組中C／C型tHcy水平高于C／T和T／T型者 （P＜0.05），C／T型與T／T型比較統(tǒng)計(jì)學(xué)無差別（P＞0.05）（見表3）。

表1 兩組tHcy水平、Hhcy檢出率及一般情況

圖1 CBS基因擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 兩組CBS基因型及其等位基因頻率分布

表3 兩組CBS不同基因型血漿tHcy水平（±s，μmmol／L）

表3 兩組CBS不同基因型血漿tHcy水平（±s，μmmol／L）

1）相同基因型中，兩組比較，P＜0.012）與同組中，不同基因型比較，P＜0.013）與同組中，不同基因型比較，P＜0.05

tHcy（μmol／L）基因型t C／C①C／T②T／T③F q ①：②①：③②：③病例組35.16±7.60 25.02±6.39 17.02±3.62 106.5461）10.142）18.142）7.802）對(duì)照組20.01±1.44 14.39±2.53 13.32±2.22 13.2041）5.633）6.702）1.07 3.3771）7.0231）7.1031）

表4 隨訪中青年腦梗死患者CBS不同基因型再發(fā)缺血性血管事件

2.5 隨訪中青年腦梗死患者CBS不同基因型再發(fā)缺血性血管事件 隨訪中青年腦梗死患者CBS不同基因型再發(fā)腦梗死發(fā)生率統(tǒng)計(jì)學(xué)無差別 （P＞0.05）；各基因型隨訪發(fā)生TIA、心肌梗死和其它血管栓塞的發(fā)生率比較，趨勢(shì)是C／C型者高于C／T和T／T型者，C／T高于T／T型者；不同基因型隨訪總的缺血性事件發(fā)生率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差別（P＜0.01）（見表4）。

2.6 各種危險(xiǎn)因素與再發(fā)缺血性血管病的關(guān)系以0.05、0.10分別作為入選和剔除自變量的顯著性水平，將tHcy、CBS基因型、年齡、性別構(gòu)成、高血壓、冠心病和糖尿病患病率、TC、TG、Glu、LDL、HDL、BMI、吸煙率、飲酒率按其作用大小依次引入回歸方程。 結(jié)果，最終選入回歸模型的有tHcy、糖尿病、高血壓和TC，其OR值分別為1.110、1.308、2.748和1.810（見表5）。

3 討論

Boysen等［4］通過對(duì)1039名卒中患者空腹血漿tHcy測(cè)定以及15個(gè)月跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)再發(fā)卒中患者血漿tHcy水平高于未再發(fā)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為Hhcy是再發(fā)卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Pettigrew等［5］在2124名卒中患者的隨訪過程中發(fā)現(xiàn)再發(fā)卒中和出現(xiàn)冠脈缺血事件患者的血漿tHcy水平高于其他患者，血漿tHcy每升高1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，卒中再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加1.16倍，冠脈缺血事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加1.27倍。本研究Logistic回歸分析顯示除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素高血壓、糖尿病、TC以外，tHcy升高也是缺血性血管病再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），優(yōu)勢(shì)比為1.11（95%CI：0.989～1.245），與前述研究觀點(diǎn)基本一致。CBS是體內(nèi)tHcy分解代謝的關(guān)鍵酶，而T833C位點(diǎn)突變是其最常見突變位點(diǎn)［6－7］，可不同程度造成其酶的缺陷而成為Hhcy患者。國外已有研究，CBS基因突變是缺血性腦血管病的危險(xiǎn)因素［8］，本研究同樣發(fā)現(xiàn)病例組CBS基因型及C等位基因頻率分布均高于對(duì)照組（P＜0.01），提示CBS T833C基因突變可能是中青年腦梗死的遺傳危險(xiǎn)因素，而CBS T833C基因突變頻率可受種族、地域、樣本量及病例選入標(biāo)準(zhǔn)等因素影響而不同。CBS缺陷可造成年輕人發(fā)生卒中及加速動(dòng)脈硬化的進(jìn)程［9－11］，同樣可引起靜脈栓塞［12］。 本研究對(duì)中青年腦梗死患者CBS T833C基因多態(tài)性研究分析并經(jīng)5年隨訪發(fā)現(xiàn)，不同基因型隨訪總的缺血性事件發(fā)生率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差別 （P＜0.01），趨勢(shì)是C／C型＞C／T型＞T／T型，提示CBS T833C基因突變可能是中青年腦梗死再發(fā)缺血事件的遺傳危險(xiǎn)因素。3種基因型隨訪再發(fā)腦梗死、TIA、心肌梗死和其他血管栓塞事件發(fā)生率的趨勢(shì)是C／C型＞C／T型＞T／T型，因考慮樣本例數(shù)少，未能行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，但仍然反映了CBS T833C突變對(duì)再發(fā)缺血性事件的不良影響，可能延長(zhǎng)隨訪時(shí)間和增大樣本量會(huì)出現(xiàn)顯著性差異。但在本研究Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)CBS T833C基因突變并未進(jìn)入回歸模型，顯示其并非再發(fā)缺血性血管病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分析其原因可能為CBS T833C基因突變對(duì)中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病產(chǎn)生的不良影響是通過Hhcy間接實(shí)現(xiàn)的，但同時(shí)血漿tHcy水平還受到N5、N10－亞甲基四氫葉酸還原酶基因、蛋氨酸合成酶基因及血漿葉酸、維生素水平等多重因素影響，故而CBS T833C基因突變?cè)诒狙芯縇ogistic回歸分析中成為 “干擾因素”被剔除，如對(duì)影響血漿tHcy水平的所有因素均進(jìn)行測(cè)定和分析，CBS T833C基因突變可能就會(huì)進(jìn)入Logistic回歸模型而成為危險(xiǎn)因素。

表5 中青年腦梗死再發(fā)缺血性血管病危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析模型

綜上，Hhcy可能與中青年腦梗死患者再發(fā)缺血性事件密切相關(guān)，而CBS T833C基因突變可引起Hhcy，過早地促進(jìn)了動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展的過程，進(jìn)而促進(jìn)了中青年腦梗死患者再發(fā)缺血性血管病的發(fā)生。在二級(jí)預(yù)防中，對(duì)中青年腦梗死患者，特別是缺少傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的年輕患者，檢測(cè)tHcy水平及CBS的基因型是非常有必要且有著積極意義，以便采取干預(yù)措施，減少再發(fā)缺血性事件的發(fā)生。

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（責(zé)任編輯：李 立）

The prospective study of cystathionine β synthase gene mutation on the recurrence of ischemic vascular disease in young and adult cerebral infarction.

LIU Huaixiang，TAN Xiaomu，LIU Jianguo，ZHANG Jing，ZHANG Zhecheng.Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin，300211，China.Tel：022－88328785.

Objective To prospectively observe the effect of cystathionine βsynthase（CBS）T833C gene on the recurrence of ischemic vascular disease（cerebral infarction， TIA， myocardial infarction， other vascular embolism）in young and adult cerebral infarction.Methods The plasma total homocystine levels and CBS T833C genetypes of 152 young and adult cerebral infarction and 84 normal objects were respectively measured by high performance liquid chromatography methods and PCR-ARMS technologies， then we observed the recurrence of ischemic vascular disease within a 5-years follow-up period.Results The difference of recurrent cerebral infarction in CBS T833C C／C homozygous mutant， C／T heterozygous mutant and T／T wild type in patient group within follow-up period，the rate of recurrence was C／C genetype（35.00%）higher by turns than C／T（22.00%）and T／T（13.41%）genetype.The tendency was C／C genetype higher than C／T and T／T genetypes，C／T higher than T／T genetypes in different genetypes follow-up TIA，myocardial infarction and other vascular embolism.There was statistical significance of total ischemic vascular disease events in following up different genetypes（P＜0.01），the rate of recurrence respectively were C／C genetype（60.00%），C／T genetype（40.00%）and T／T genetype（23.17%）.By forward stepwise lo-gistic analysis， we found that the increased tHcy level was a independent risk factor of recurrent ischemic vascular disease（OR＝1.110；95%CI：0.989～1.245，P＜0.05），but CBS T833C gene mutation was not in the regression model.Conclusions The plasma tHcy level increase was a independent risk factor of recurrence ischemic vascular disease in young and adult cerebral infarction， CBS T833C gene mutation caused tHcy level rise and was probably susceptibility gene of recurrent ischemic vascular disease.

Cystathionine βsynthase Cerebral infarction Hhomocystine Young and adult Recurrence

R743.3

A

2010－12－27）

☆ 天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：00360411）

* 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（天津300211）

△ 北京市潞河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

※ 北京海軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

⊙ 天津市第三中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

（E-mail：zzc0912＠yahoo.com.cn）