負載hTERTC27基因的樹突狀細胞對膠質瘤細胞的殺傷效應☆

龔漢賢何蕾黎祥噴李藝彭英

·論 著·

負載hTERTC27基因的樹突狀細胞對膠質瘤細胞的殺傷效應☆

龔漢賢*何蕾*黎祥噴*李藝*彭英*

目的 探討負載hTERTC27基因的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）治療膠質瘤的可行性。方法利用重組腺病毒（recombinant adenovirus，Adv）將hTERTC27基因轉染到DCs，Western blot雜交鑒定hTERTC27蛋白的表達。實驗分為3組：hTERTC27轉染的DCs，單純強化綠熒光蛋白（EGFP）轉染的DCs和單純的DCs。CCK8法檢測各組DCs對淋巴細胞的增殖作用及誘導的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）對膠質瘤細胞U87的殺傷活性，ELISA法檢測T細胞上清中白介素-2（IL-2）和 干擾素-γ（IFN-γ）的表達。結果hTERTC27轉染的DCs組對T細胞的增殖作用以及T細胞上清IL-2、IFN-γ的濃度均高于其余兩組，當效靶比為40∶1時，這組T細胞對U87的殺傷率（50.4%±2.95%），也明顯高于EGFP轉染DCs組（38.0%±1.81%）以及單純DCs組（33.7%±2.03%）（P＝0.001）。結論 hTERTC27基因轉染的DCs能誘導CTL反應，對端粒酶陽性的U87具有顯著的殺傷效應。

樹突狀細胞 膠質瘤 hTERTC27 細胞毒性T淋巴細胞

端粒酶與細胞的衰老和永生化密切相關，它的激活對腫瘤的發生、發展起著重要作用［1］。端粒酶逆轉錄酶（TERT）是端粒酶的一個催化亞單位，在調控端粒酶活性中最具有特異性，被認為是理想的腫瘤相關抗原（TAA）［2］。hTERTC27（C27）是一個27 kD的人端粒酶逆轉錄酶C-末端多肽。樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是功能最強大的抗原呈遞細胞，在抗腫瘤免疫反應中發揮至關重要的樞紐作用［3］。本實驗利用腺病毒把hTERTC27的基因轉染到DCs上，觀察其在體外能否刺激T細胞的增殖和誘導細胞毒性T細胞（CTL）的活性，初步探討其誘導的抗腫瘤機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 SPF級C57BL／6小鼠20只，體質量（20±2）g，購自中山大學中山醫學院實驗動物中心。膠質瘤細胞U87購自中科院上海細胞庫。胎牛血清購自Gibco公司，重組小鼠GM-CSF和重組小鼠IL-4購自R＆D公司，PE標記抗小鼠CD80、CD86、MHC-Ⅱ單抗購自Biosciences公司，脂多糖（LPS）購自Sigma公司，CCK8購自Dojindo公司。

1.2 培養與純化小鼠骨髓來源的DCs 無菌剝離C57BL／6小鼠的股骨和脛骨，剪至紅骨髓。將骨髓沖至篩網中，過濾離心，棄上清后加紅細胞裂解液，裂解5 min，加入RPMI-1640離心，細胞沉淀加入RPMI-1640完全培養基（含10%胎牛血清），接種至6孔培養板，加入10 ng／mL的rmGM-CSF、5 ng／mL的rmIL-4。第3 d換含相同濃度細胞因子的完全培養液。至第5 d半量換液并補足細胞因子。至第6 d與200 ng／mL LPS共培養24 h后，輕輕吹打收集所有的懸浮細胞。

1.3 流式細胞儀檢測DCs表型 收集培養至第7 d的 DCs，調整細胞密度為1×106／mL，按試劑說明書加入PE標記的抗小鼠單克隆抗體CD80、CD86和MHC-Ⅱ，設立空白對照，4℃避光反應30 min，PBS洗兩次，流式細胞檢測儀檢測。

1.4 利用重組腺病毒轉染基因 6孔板中加入1× 106／mL的DCs，分別加入感染復數（MOI）＝200的病毒液AdvC27-EFGP和Adv-EGFP，每組3個復孔，37℃的培養箱中培養48 h，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 Western blot分析hTERTC27蛋白表達 按感染復數（MOI）＝200的濃度加入Adv-hTERTC27-EGFP（AdvC27-EGFP），Adv-EGFP至DCs中，提取轉染48 h的DCs細胞蛋白，經10%的SDS-聚丙烯酰胺不連續分離膠（SDS-PAGE）電泳后，移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，與兔抗的hTERT抗體4℃孵育過夜，TBST洗3次，與Peroxidase標記的兔抗IgG室溫下作用1 h，TBST洗3次用ECL發光液作用45 min，X線膠片曝光顯影。

1.6 同種異體混合淋巴細胞反應（MLR）檢測T細胞的增殖情況 將C57BL／6小鼠脾臟分離出來，制備成單細胞懸液，用Ficoll分離液分離出單個核細胞，將單個核細胞懸液過尼龍毛柱獲取純化的T淋巴細胞［4］。將濃度為1×105／mL AdvC27-EGFP-DCs、Adv-EGFP-DCs和單純的DCs（n＝3）接種到96孔板中，作為刺激細胞（S）；將同種異體 T細胞作為反應細胞（R），使刺激細胞：反應細胞（S∶R）為1∶40、1∶20、1∶10和1∶5，每組3個復孔。培養3 d，在培養結束前6 h每孔加入20 μL的CCK8，于酶標儀450 nm處讀取吸光度值。

1.7CCK8法檢測CTL的殺傷活性 利用DMEM培養液（內含10%的胎牛血清）里，于37℃、含5% CO2的培養箱中培養膠質瘤細胞U87。收集該細胞按每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板中，作為靶細胞，以分別轉染了AdvC27-EGFP、Adv-EGFP的DCs及DCs共同培養24 h的T細胞作為效應細胞，效靶比為5∶1、20∶1和40∶1，另外設只有靶細胞和只有效應細胞的對照，每組 3個復孔，共培養 48 h，用CCK8法檢測各組在波長450 nm下吸光度值。按下式計算CTL的殺傷活性殺傷率＝［1－（效靶孔值－效應孔值）／靶細胞孔值］×100%

1.8 轉基因淋巴細胞分泌細胞因子的檢測 將濃度為1×105／mL轉染了AdvC27-EGFP、Adv-EGFP的DCs和單純的DCs接種到96孔板中，作為刺激細胞，按刺激細胞：反應細胞（S：R）為1∶10加入淋巴細胞，每組3個復孔，培養 3 d，收集各孔上清，檢測IL-2和IFN-γ的含量，具體步驟按ELISA試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 DCs的分離、培養及鑒定 成功培養出成熟的小鼠骨髓來源的DCs。培養至第7 d，大量細胞懸浮起來，部分聚集成團生長，集落分散。懸浮的細胞體積較大，形態不規則，有大小不等的毛刺狀、星狀或者樹突狀的突起。見圖1。

2.2 DCs表型檢測鑒定 流式細胞儀檢測顯示加入 LPS刺激后的 DCs表面標志 CD80、CD86和MHC-Ⅱ均高表達，陽性率分別為87.3%，88.8%和93.8%，表明我們成功培養出成熟的DCs。見圖2。

2.3 重組腺病毒作為載體轉染基因 分別加入感染復數（MOI）＝200的病毒液rAd-C27和rAd-EGFP，37℃的培養箱中培養48 h，熒光顯微鏡下可觀察到兩組的DCs細胞均有大量的綠色熒光蛋白的表達。rAd-C27組表達率約為70%，而rAd-EGFP組的表達率約為75%（圖3）。

2.4 hTERTC27蛋白的鑒定 Western blot鑒定中，僅 AdvC27-EGFP轉染的 DCs可以檢測到hTERTC27蛋白表達；而轉染Adv-EGFP和空白對照的DCs，均未能檢測到hTERTC27蛋白存在，提示hTERTC27基因轉染成功（圖4）。

2.5 轉染的DCs刺激同種異體增殖能力的檢測

在同種異體混合淋巴細胞反應（MLR）中，隨著刺激細胞／反應細胞 （S／R）比值的增大，AdvC27-EGFP DCs組的T細胞增殖明顯增多，而Adv-EGFP DCs組及DC組的T細胞增殖活性不明顯。當S／R≥1∶10時，AdvC27-EGFP DCs與其余兩組相比，具有更強的刺激T淋巴細胞增殖的能力（P＜0.01），而Adv-EGFP DCs組及DC組相比差異亦無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.6 CTL對U87細胞的特異性殺傷活性 隨著效靶比的增高，三組CTL的殺傷率均有增高，但AdvC27-EGFP DCs組的殺傷率增高的趨勢更加明顯。當效靶比為40∶1時，AdvC27-EGFP DCs組的殺傷率為（50.38%±2.95%），明顯高于Adv-EGFP DCs組（38.32%±2.21%）和 DC組（35.7%±2.03%）（P＝0.001）。見表2。

2.7 T細胞上清IL-2和IFN-γ的濃度 AdvC27-EGFP DCs組中T細胞上清IL-2和IFN-γ的 濃度較高，IL-2：（75.54±5.32）pg／mL，IFN-γ：（60.86± 2.61）pg／mL；Adv-EGFP DCs組中 IL-2：（51.83± 1.39）pg／mL，IFN-γ：（15.10±1.36）pg／mL。DCs組中 IL-2：（57.23±6.30）pg／mL，IFN-γ：（16.33± 0.29）pg／mL。可見，AdvC27-EGFP DCs組的 IL-2和IFN-γ的濃度均高于其余兩組（P＜0.01），見表3。

圖1 倒置顯微鏡下觀察小鼠骨髓來源的DCs（×200）

圖2 小鼠骨髓來源的DCs表面標志物

圖3 EGFP蛋白在DCs細胞的表達。A為AdvC27-EGFP DCs轉染的DCs；B為Adv-EGFP轉染的DCs。左圖為熒光顯微鏡下圖像，右圖為倒置顯微鏡下圖像。

圖4 western blot測定各組DCs中hTERTC27蛋白的表達。

表1 同種異體混合淋巴細胞反應（MLR）中的刺激作用

表2 不同效靶比T細胞對靶細胞的CTL殺傷活性

表3 T細胞上清中IL-2和IFN-γ的濃度比較

3 討論

近幾年，以腫瘤抗原作為靶點的腫瘤疫苗吸引了越來越多的注意，因為相對其他非手術途徑，它具有更高的特異性和更少的毒性。腫瘤疫苗可以分為肽／蛋白疫苗、腫瘤細胞疫苗、DNA疫苗、重組病毒疫苗和DCs疫苗。其中DCs疫苗具有明顯的優勢，因為它能呈遞抗原肽或者DNA編碼的抗原，刺激免疫細胞，觸發免疫反應。在本實驗中，我們發現AdvC27-EGFP-DCs不僅能夠促進T細胞增殖，而且能引發CTL溶解腫瘤細胞。但是，有報道稱［5］，在小鼠體內AAV-／Adv-hTERTC27病毒雞尾酒僅能引起NK細胞反應，而不能刺激T細胞的反應。這結論與本實驗結果明顯不相符合。我們猜測這是因為：AAV-／Adv-hTERTC27內包含的抗原過少，不足以引發細胞免疫反應；本實驗中的DCs能攝取、加工并呈遞抗原，從而增強抗原引起的免疫作用。Nestle等［6］報道，在臨床實驗中負載腫瘤相關肽或者腫瘤裂解物的DCs能夠促發人體免疫反應，抑制腫瘤生長。可是單獨的黑色素瘤抗原，沒有DCs，就不能引起具有統計意義的臨床反應。由此可見，DCs能夠減少或者避免腫瘤細胞的免疫逃避，DCs疫苗是腫瘤免疫治療的理想途徑之一。

人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）可作為廣泛的腫瘤相關抗原，是腫瘤治療理想靶點。V hTERT蛋白包含1032個氨基酸，經過不斷地分析，已經篩選出很多種可能的抗原肽［7］。hTERTC27，作為hTERT的C末端 27 kD的多肽，p973和 p988是目前確定里面包含的抗原肽［8］。這兩種抗原肽在體內外均可以誘導CD8＋T淋巴細胞殺傷hTERT＋的腫瘤細胞［9］。這也是本實驗中觀察到AdvC27-EGFP-DCs引起的CTL明顯高于其他組的重要原因。

細胞因子是細胞間信號肽的大家族的成員，能夠調節腫瘤的免疫反應，在腫瘤治療中起重要的作用。IL-2能夠提高細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞溶解細胞的能力，提高基因的表達從而翻譯出具有細胞毒性的顆粒成分，如穿孔素和顆粒蛋白酶［10］。IFN-γ是細胞免疫的主要影響因子之一，它既能誘導CTL和輔助性T淋巴細胞的分化，又能提高MHC-I和MHC-II的表達，促進抗原呈遞給淋巴細胞［11］。本實驗，AdvC27-EGFP-DCs組中T淋巴細胞上清的IL-2和IFN-γ明顯增多，這可能也是實驗組能夠促進CTL殺傷腫瘤細胞的重要原因之一。

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The killing effect induced by dendritic cells transduced with hTERTC27 gene on Glioblastoma Cells.

GONG Hanxian，HE Lei，LI Xiangpen，LI Yi，PENG Ying.Department of Neurology，the Sun Yat-Sen Memorial Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510120，China.Tel：020－81332833.

Objective To explore the feasibility oftreatment with dendritic cells（DCs）transduced with hTERTC27 for glioma. Methods hTERTC27 gene was transduced to the DCs by recombinant adenovirus and hTERTC27 protein was detected using western blot.The DCs were divided into 3 groups： hTERTC27-transfected DCs，EGFP-transfected DCs and DCs only.T cells proliferation and cytotoxic T lymphocytes（CTL）response to U87 cells induced by DCs were detected in each group using CCK8.The concentration of interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）in the supernatants of T cells were detected by using ELISA.Results T cell proliferation and the concentration of IL-2 and IFN-γ were higher in the hTERTC27-transfected DCs than in the other groups.The cytotoxic rate against U87 in the hTERTC27-transfected DCs was（50.4%±2.95%）at the ratio of effect／target cells of 40∶1，which was much higher compared with EGFP-transfected DCs group（38.0%±1.81%）and the DCs only group（33.7%±2.03%）（P＝0.001）. Conclusions hTERTC27 gene-transduced DCs can induce CTL response and has strong killing effect on hTERT＋U87 cells.

Dendritic cells Glioma hTERTC27 CTL

R741.05

A

2011－03－10）

（責任編輯：甘章平）

☆ 國家“863”計劃項目 （編號：2007AA021101）

* 中山大學孫逸仙紀念醫院神經內科（廣州 510120）

（E-mail：docpengy＠yahoo.com.cn）