飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬腎臟結構與功能的影響

王 蔚 陳代文 毛湘冰 陳 洪 余 冰

(四川農業大學動物營養研究所，雅安 625014)

飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬腎臟結構與功能的影響

王 蔚 陳代文 毛湘冰 陳 洪 余 冰*

(四川農業大學動物營養研究所，雅安 625014)

本文旨在研究飼糧中三聚氰胺的添加在育肥豬腎臟中的殘留及其對腎臟結構與功能的影響。試驗選用體重為60 kg的杜洛克×長白×大白生長育肥豬36頭，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復2頭豬。采用單因子試驗設計，試驗飼糧為玉米－豆粕型基礎飼糧中分別添加0、500和1 000 mg/kg的三聚氰胺。試驗期47 d，分2個階段，即42 d的殘留試驗和5 d的清除試驗。結果表明:1)飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬的生長性能沒有顯著影響(P＞0.05);2)飼糧中三聚氰胺的添加可導致腎臟腎小管發生明顯病理變化，且較高劑量(1 000 mg/kg)的三聚氰胺會影響育肥豬血清中谷丙轉氨酶的活性和肌酐的濃度(P＜0.05);3)育肥階段飼糧中三聚氰胺的添加會導致其在育肥豬腎臟中的殘留，且殘留量超過美國食品藥品監督管理局規定的食品中三聚氰胺2.5 mg/kg的限量標準，而在進行5 d的清除試驗后，試驗組育肥豬腎臟中三聚氰胺的殘留量下降到安全限量標準以下，但是腎臟損傷并未得到恢復。結果提示:飼糧中較高劑量(≥1 000 mg/kg)三聚氰胺的添加會對育肥豬腎臟造成損傷，進行清除后，腎臟中三聚氰胺殘留量可下降至安全限量標準以下，但腎臟損傷不可恢復。

三聚氰胺;育肥豬;腎臟;結構與功能

三 聚 氰 胺 (2，4，6-triam ino-s-triazine，melamine)是一種化工原料，其與食品、飼料行業的聯系源自2007年美國發生的“寵物毒糧”事件［1］。由于目前國際上通用的測定飼料和食品中粗蛋白質含量的方法是“凱氏定氮法”，即以飼料和食品中含氮量乘以6.25得出粗蛋白質含量，而三聚氰胺(含氮量66%)加入后，可提高含氮量，因此，有不法分子便利用三聚氰胺這一特點，在飼料或食品中加入三聚氰胺以造成蛋白質含量高的假象。美國食品藥品監督管理局(U.S.Food and Drug Adm inistration，FDA)關于三聚氰胺添加到飼料中產生副作用的報道認為，三聚氰胺在貓和狗體內產生的腎毒性導致了腎結石以至于最后的腎衰竭［2］。前人的研究也發現，三聚氰胺對動物的毒性主要表現為腎毒性。Xie等［3］在大鼠上的研究發現，飼料中添加1 000 mg/kg三聚氰胺處理的大鼠的腎出現水腫，腎重量也比對照組有所提高。組織病理學檢查發現該組大鼠的腎臟遠端小管出現大量的管狀擴張和少量的出血，腎間質有炎癥發生，晶體主要沉積在腎乳頭的集合管中。在家禽上的研究發現，隨著三聚氰胺劑量的升高，腎損傷的發生率上升，且腎臟的損害程度與三聚氰胺劑量的增加有關［4－5］。腎臟是三聚氰胺殘留和造成危害的主要靶器官，且腎臟在生豬屠宰檢疫中有著非常重要的診斷意義。但三聚氰胺對育肥豬腎臟結構與功能是否有不利的影響仍有待研究。因此，本研究針對人為在飼糧中添加三聚氰胺的情況，開展三聚氰胺對育肥豬腎臟結構與功能的影響，以及三聚氰胺在育肥豬腎臟中殘留情況的研究，探索三聚氰胺是否能殘留在育肥豬腎臟組織中，及其對育肥豬健康的影響，為禁止三聚氰胺在飼料中的違規添加提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

三聚氰胺:純度≥98.5%，購自成都市科龍化工試劑廠;三聚氰胺標準品(純度≥99%，美國Sigma-A ldrich公司);［15N3］－三聚氰胺(純度≥98%，美國CIL公司);乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司);正己烷、甲酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠);超純水。

Agilent 1200高效液相色譜儀，配備G1322A脫氣機、G1311A四元泵、G1316B柱溫室、G1329A自動進校器以及20μL定量環(W ilm ington，DE，USA);API 2000液相色譜/質譜聯用儀，配備電噴霧離子源(ESI)(AB Sciex Instruments，USA)。

1.2 試驗動物與飼糧

選擇初始體重為60 kg左右的健康杜洛克×長白×大白生長育肥豬進行試驗。采用玉米－豆粕型基礎飼糧(粉料)，參照 NRC(1998)50～100 kg生長育肥豬營養需要量配制。在基礎飼糧中分別添加0、500和1 000 mg/kg的三聚氰胺。基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.3 試驗設計與飼養管理

試驗選用初始體重為60 kg左右的健康杜洛克×長白×大白生長豬36頭，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復2頭豬。試驗期共計47 d。試驗分2個階段進行，前42天進行殘留試驗，所有組飼喂配制飼糧;后5天進行清除試驗，所有組飼喂基礎飼糧。試驗在四川農業大學動物營養研究所試驗農場進行。試驗前對豬舍進行徹底消毒，清洗料槽、水槽，并對試驗豬進行常規免疫與驅蟲。試驗期內，前1天晚上稱取飼料，放于料桶中，次日進行飼喂。豬的飼養采用自由飲水，每天飼喂2次(08:30和16:30)，采取少喂勤添的原則，保證料槽有少量剩余。每天記錄溫度及濕度。保持圈舍通風、清潔、干燥。每周對圈舍用百毒殺噴霧消毒。并于每天結算余料，做好采食量記錄。

1.4 樣品采集

于殘留試驗階段第14天、第28天和第42天，采集試驗豬頸靜脈血液，加入不含抗凝劑的試管中，3 500 r/m in離心10 m in分離血清，－20℃保存。

試驗期的第42天和第47天，每組隨機選取4頭試驗豬，屠宰后取左腎，－70℃保存待測三聚氰胺殘留量。另于左腎取1 cm3大小的腎臟1塊，置于3.8%甲醛溶液中固定1周，用于腎臟組織學檢測。

1.5 生長性能

試驗期每日記錄給料及耗料量，試驗期的第14天、第28天和第42天，試驗豬空腹12 h后個體稱重，用于計算試驗豬平均日采食量、平均日增重及料重比。

1.6 血清生化指標測定

取血清樣品，測定其中谷丙轉氨酶(glutamatepyruvate transam inase，GPT)和谷草轉氨酶(glutamic-oxalacetic transam inase，GOT)活性及肌酐(creatinine，CRE)含量。血清 CRE含量、GPT和 GOT活性均采用比色法在紫外分光光度計上測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.7 腎臟組織學檢察

將固定于3.8%甲醛溶液中腎臟組織塊進行石蠟包埋，并制成切片，經蘇木精－伊紅染色后置顯微鏡下觀察腎臟損傷程度，并取圖和拍照［6］。

1.8 血漿及組織中三聚氰胺的檢測

1.8.1 標準工作溶液的配制與樣品的前處理

參照Lv等［7］的方法進行標準溶液的配制和樣品的前處理。

1.8.2 三聚氰胺的檢測

試驗測定三聚氰胺所使用的方法是Lv等［7］所述檢測三聚氰胺的方法。該方法線性范圍為2～500 ng/m L，使用標準品工作溶液所建立的三聚氰胺測定標準曲線回歸方程為Y=0.034 7X+0.061 3(R2=0.993)，根據信噪比(signal to noise，S/N)為3/1和10/1來計算檢出限(lim it of detection，LOD)和定量限(lim it of quantitation，LOQ)。三聚氰胺的 LOD和 LOQ分別是0.02和0.05 μg/m L(血漿)，0.02 和 0.05 μg/g(組織)。三聚氰胺的回收率范圍為90% ～110%，相對標準差＜10%。

1.9 數據處理

所有數據用Excel軟件進行處理。采用SAS 9.2統計軟件的ANOVA過程進行3個組試驗數據的單因素方差分析。差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬生長性能的影響

由表2可知，整個試驗期內，添加三聚氰胺組與對照組育肥豬的生長性能無顯著差異(P＞0.05)。

表2 飼糧中三聚氰胺的添加對生長育肥豬生長性能的影響Table 2 Effects of dietary melam ine on growth performance of finisher pigs(n=6)

2.2 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬血清生化指標的影響

從表3可以看出，試驗期的第28天，飼糧中添加1 000 mg/kg三聚氰胺組育肥豬血清中CRE含量顯著高于對照組和添加500 mg/kg三聚氰胺組(P＜0.05)，且分別提高了 22.7% 和 10.0%;第42天，添加1 000 mg/kg三聚氰胺組育肥豬血清中GPT活性顯著高于對照組和添加500 mg/kg三聚氰胺組(P＜0.05)，且分別提高了 46.4% 和29.2%。除此之外，在第14天、第28天和第42天，血清中GOT、GPT活性和CRE含量都有隨添加量增加而升高的趨勢，但差異均不顯著(P＞0.05)。由 此 說 明，育肥豬攝入添加 500或1 000 mg/kg三聚氰胺的飼糧后，其肝臟、腎臟功能有可能受到輕微損傷，但可能隨時間的延長而有一定恢復。

表3 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬血清生化指標的影響Table 3 Effects of dietary melam ine on serum biochem ical parameters in finisher pigs(n=6)

2.3 飼糧中的三聚氰胺在腎臟中的殘留與清除

由表4可知，試驗期的第42天，與對照組相比，飼糧中添加500和1 000 mg/kg三聚氰胺顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)提高了育肥豬腎臟組織中三聚氰胺的殘留，且殘留水平超過國際上普遍采用的食品中三聚氰胺殘留限量標準(2.5 mg/kg)。另外，三聚氰胺在腎臟中的殘留量與飼糧中三聚氰胺的添加濃度有關，即攝入含1 000 mg/kg三聚氰胺飼糧的育肥豬的腎臟三聚氰胺殘留量顯著高于攝入含500 mg/kg三聚氰胺飼糧的育肥豬(P＜0.05)。試驗期的第47天，添加三聚氰胺組育肥豬腎臟中三聚氰胺的殘留量迅速下降，飼糧中添加500 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟組織中三聚氰胺含量與對照組無顯著差異(P＞0.05)，說明攝入含500 mg/kg三聚氰胺飼糧的育肥豬腎臟中殘留的三聚氰胺已基本清除。但飼糧添加1 000 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟中三聚氰胺殘留量仍顯著高于添加500 mg/kg三聚氰胺組和對照組(P＞0.05)。

表4 育肥豬腎臟中三聚氰胺的殘留與清除Table 4 Melam ine deposition and depletion in kidney of finisher pigs(n=4)

2.4 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬腎臟組織的影響

圖1－A至圖1－F為試驗期第42天和第47天的育肥豬腎臟組織切片圖。由圖1－A和圖1－D可以發現，對照組育肥豬腎臟無明顯病變。由圖1－B可見，添加500 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟組織出現腎小管和集合小管管壁變薄、通透性增大，上皮細胞空泡化等病理變化。由圖1－C可見，添加1 000 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟組織出現以局部腎小管和集合小管正常結構受損、管壁變薄、通透性增大、上皮細胞空泡變性、壞死等為特征的病理變化。且在進行清除試驗5 d后，添加500和1 000 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟組織受損并未恢復，如圖1－E和圖1－F所示。

圖1 第42天和第47天育肥豬腎臟組織切片圖Fig.1 The kidney slice diagrams of finisher pigs at day 42 and 47(400 × )

3 討論

3.1 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬生長性能的影響

黃小燕［8］在仔豬上的研究發現，飼糧中添500或1 000 mg/kg的三聚氰胺會導致仔豬日采食量顯著低于對照組仔豬。但本試驗中，相同劑量的三聚氰胺添加未對育肥豬生長性能造成顯著影響。這可能是由于斷奶仔豬的胃酸分泌不足，胃液pH高于成年豬，不能達到胃蛋白酶活性最優的水平造成的。這一結果提示了三聚氰胺對成年動物的危害可能遠遠不及幼齡動物。李倜［9］研究了飼糧中添加三聚氰胺對肉雞生產性能的影響，結果發現，當飼糧中三聚氰胺濃度高于1 000 mg/kg時，料重比顯著提高。柏雪［5］的研究發現，蛋雞持續攝入濃度小于2 000 mg/kg三聚氰胺的飼糧后，蛋雞的產蛋率和采食量并無顯著變化，僅平均蛋重有下降趨勢。其他一些研究也表明，飼糧中低劑量(≤1 000 mg/kg)的三聚氰胺均未對奶牛、魚、綿羊和山羊等動物的生產性能造成不利影響［10］。育肥豬對蛋白質的需要量不如仔豬、肉雞和產蛋高峰期的蛋雞，因此，由于添加三聚氰胺所造成的蛋白質缺乏可能不會對育肥豬造成顯著影響。但三聚氰胺的添加是否會影響蛋白質沉積從而對豬肉品質產生影響有待進一步研究。

3.2 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬血清生化指標的影響

GPT與GOT主要分布在肝臟的肝細胞內。肝細胞壞死時GPT與GOT活性會升高，且升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標。但GPT主要存在于細胞漿中，很容易從細胞內逸出，靈敏度非常高，輕度肝細胞損傷時即可表現出明顯升高。這也就解釋了本試驗中的發現，即育肥豬持續攝入1 000 mg/kg的三聚氰胺后，會導致血清GPT活性極顯著升高，但并未對血清GOT活性產生影響。而這與柏雪［5］在蛋雞上的研究結果一致。這些結果說明飼糧中添加1 000 mg/kg的三聚氰胺僅會導致動物肝臟的輕微損傷。Neerman等［12］研究發現，從肝臟組織病理切片上看，注射三聚氰胺的劑量達到10 mg/kg時對小鼠肝臟沒有損傷，但是當劑量達到40 mg/kg時，將會造成肝壞死。這些結果的差異可能與受試動物種屬、三聚氰胺添加劑量、給予方式和試驗期不同有關。

3.3 飼糧中的三聚氰胺在腎臟中的殘留與清除

許多研究均表明，三聚氰胺殘留和損傷的主要靶器官為腎臟。本試驗研究發現，育肥豬持續攝入含1 000 mg/kg三聚氰胺的飼料42 d后，腎臟中三聚氰胺的殘留量超過美國FDA［2］規定的食品中三聚氰胺限量2.244倍。在進行5 d的清除試驗后，腎臟中的三聚氰胺濃度迅速下降，飼糧中添加500 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟中的三聚氰胺已基本得到清除，但飼糧中添加1 000 mg/kg三聚氰胺組的育肥豬腎臟中三聚氰胺的殘留量仍處于相對較高的水平。Li等［13］研究發現，生長豬攝入含100 mg/kg三聚氰胺飼料42 d后，腎臟中三聚氰胺濃度達到1.91 mg/kg，而在停止在飼料中添加三聚氰胺5 d后，殘留量下降到0.1 mg/kg。這說明三聚氰胺在腎臟中的殘留量與三聚氰胺的攝入量有相關關系，即飼料中三聚氰胺的濃度越高，則三聚氰胺在腎臟中的殘留量越大，且需要更長的時間才能完全清除。Lv等［7］在羔羊上的研究發現，在攝入含100 mg/kg三聚氰胺的飼料53 d后，腎臟中三聚氰胺的濃度達到1.07 mg/kg。另外，大鼠持續攝入添加了100 mg/kg三聚氰胺的飼料14 d后，腎臟中的三聚氰胺濃度達到19.48 mg/kg［10］。這種三聚氰胺殘留水平的差異可能是由于動物的種屬差異，或攝入三聚氰胺的方式、時間長短及劑量不一致所導致。

3.4 飼糧中三聚氰胺的添加對育肥豬腎臟功能的影響

CRE是一種小分子物質，可通過腎小球濾過，在腎小管內很少被吸收。每日人體內產生的CRE，幾乎全部隨尿排出，一般不受尿量影響。由于CRE清除率決定于腎小球濃縮功能，在腎濃縮功能受損時，血中CRE水平是反映腎小球功能的最可靠指標。本試驗研究發現，在攝入含1 000 mg/kg三聚氰胺的飼糧28 d時，育肥豬血中CRE水平顯著升高，但在42 d時，育肥豬的血中CRE水平與對照無顯著差異。這說明長期攝入三聚氰胺可能會對腎濃縮功能造成損傷，但這種損傷并不是不可逆的。這些結果與李倜［9］在肉雞上的報道一致，即在停止攝入三聚氰胺后，肉雞腎功能有一定的恢復。

另外，本試驗對腎臟病理切片的觀察發現，飼糧中添加1 000 mg/kg三聚氰胺組育肥豬腎臟組織出現局部腎小管和集合小管正常結構受損、管壁變薄、通透性增大、上皮細胞空泡變性、壞死等病理變化。Reimschuessel等［14］的研究也發現仔豬持續攝入三聚氰胺后，腎臟淋巴細胞出現浸潤，腎小管管腔中出現晶體。黃小燕［8］在仔豬上的研究發現，飼糧中添加1 000 mg/kg三聚氰胺會導致仔豬腎臟皮質和髓質都有不同程度的損傷，但并未出現結石。給狗連續飼喂含三聚氰胺(1 200 mg/kg)飼糧60 d后，在狗的尿液中觀察到三聚氰胺結晶體，但未見其他不利影響［10］。在飼喂大鼠含1 000 mg/kg三聚氰胺的飼糧15 d后，對腎臟的組織病理學檢查發現大鼠腎臟遠端小管出現大量的管狀擴張和少量的出血，腎間質有炎癥發生［3］。這些研究均表明，較高劑量(≥1 000 mg/kg)三聚氰胺的添加能造成動物腎臟發生病變，只是病變的程度有所不同，這可能是由于動物個體大小差異和動物種屬不同所致。體重越大的動物，腎臟越不易出現結石，這可能與單位體重攝入三聚氰胺劑量的不同有關。

4 結論

① 本研究表明，盡管飼糧中500或1 000 mg/kg三聚氰胺的添加不會對育肥豬的生長性能造成顯著影響，但較高劑量(≥1 000 mg/kg)的三聚氰胺仍會對育肥豬肝臟和腎臟造成損傷。

②育肥階段飼糧中三聚氰胺的添加會導致其在育肥豬腎臟中的殘留，且殘留量超過美國FDA規定的食品中三聚氰胺2.5 mg/kg的限量標準，在進行5 d的清除試驗后，試驗組育肥豬腎臟中三聚氰胺的殘留量下降到安全限量標準以下，但是腎臟損傷并未得到恢復。

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*Corresponding author，associate professor，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn

(編輯 田艷明)

Toxicity of Melam ine:Dam age on the Structure and Function of K idneys in Finisher Pigs

WANG Wei CHEN Daiwen MAO Xiangbing CHEN Hong YU Bing*
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China)

This study was conducted to investigate the effects of dietary melam ine on structure and function of kidney and its deposition and depletion in kidney tissue of finisher pigs.Thirty-six Duroc，Landrace，and Large White finisher pigswere random ly assigned to 3 groupswith 6 replicates in each group and 2 pigs in each replicate.According to a single-factor experimental design，pigs in 3 groupswere fed diets supplemented with 0，500 and 1 000 mg/kgmelam ine in the basal diet，respectively.The experiment lasted for 47 d with two stages.Animalswere fed the experimental diets for 42 d in the deposition experiment，and then pigs in all groups

the basal diet for5 d in the depletion experiment.The results showed that500 and 1 000 mg/kgmelamine supplementation had no significant effects on the performance of the finisher pigs(P＞0.05).The administration of melam ine would lead to obvious pathological change in kidney，and higher dosage(1 000 mg/kg)of melam ine would have significant effects on the glutamate-pyruvate transam inase activity and creatinine concentration in the serum of finisher pigs(P＜0.05).Dietarymelam ine could lead to its deposition in the kidney of the finisher pigs，and the supplemental level at1 000 mg/kg made themelam ine residue in kidney tissue exceed the safety lim itof 2.5 mg/kg，which was set by U.S.Food and Drug Adm inistration.After withdrawal ofmelam ine in the feed for 5 d，the melam ine residues in pigs of two experimental groups were decreased to below the safety lim it，but the lesion of kidney was not recovered.It is concluded thathigher doses(≥1 000 mg/kg)of melam ine in the diet can damage the kidneys of finisher pigs，and after elim inating，the melam ine level can be under the safety lim it，but the lesion of kidney is not recovered.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1584-1591］

melam ine;finisher pig;kidney;structure and function

S828

A

1006-267X(2011)09-1584-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.018

2011－03－16

四川省科技支撐計劃項目(09NZ0055)

王 蔚(1987—)，女，蒙古族，河南南陽人，碩士研究生，從事三聚氰胺與育肥豬的研究。E-mail:iwe.wang@gmail.com

*通訊作者:余 冰，副教授，碩士生導師，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn