實時熒光定量PCR在植物害蟲研究中的應用

郭慶，王忠躍，孔繁芳，武艷霞

（中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

1983年美國PE Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis發明了聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）[1]，該體外核酸擴增技術具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點，被廣泛應用于基礎研究，成為分子生物學、鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒和病菌感染必不可少的研究工具。1992年日本人Higuchi想實時觀察PCR反應的全過程，最終達到檢測樣品中的DNA量的目的，最早提出了實時熒光定量PCR的設想[2,3]，繼而由1996年美國Applied Biosystems公司首先推出實時熒光定量PCR技術。由于傳統的PCR技術都是依賴于產物的終點濃度進行分析的，存在不能準確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，使其應用受到局限，直到近年來熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技術用于PCR定量后，上述問題才得到較好的解決[4]，隨著實時熒光定量PCR的發明，此技術在不同研究領域都發揮出重要作用[5～8]。

實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）是在常規PCR技術基礎上把熒光共振能量轉移與熒光標記探針相結合，并巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術融合在一起的一項創造性技術，該技術不僅實現了對DNA模板的定量，它具有實時性、快速、靈敏、高通量、特異性強、自動化程度高、重復性好、準確定量等特點。

近年來，實時熒光定量PCR技術不斷完善，取得了突飛猛進的發展。由于該技術本身的優越性，被廣泛應用于醫療檢測、藥物療效考核、基因表達研究、轉基因研究、基因檢測、病原體檢測、動植物檢測、食品安全等不同研究領域[9,10]。目前，實時熒光定量PCR技術成為分子生物學研究中的重要工具[11～12]，而在植物害蟲研究上的報道相對其他領域較少，但是隨著最近幾年實時熒光定量PCR技術的發展，有力地促進了植物害蟲研究水平的提高，而且發揮著越來越重要的作用，已經顯示出了極好的應用前景。

1 實時熒光定量PCR概述

1.1 熒光共振能量轉移原理

實時熒光定量PCR的原理的基礎是熒光共振能量轉移原理，熒光共振能量轉移原理（fluorescence resonance energy transfer, FRET），是指當一個熒光分子（供體分子）的發射光譜與另一個熒光分子（受體分子）的吸收光譜相重疊時，且兩個集團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，相當于短波長熒光集團釋放的熒光被屏蔽，這個過程稱為FRET。

1.2 實時熒光定量PCR的原理

實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行，擴增產物不斷積累，熒光信號的強度不斷增加。每經過一個循環，收集一次熒光強度信號，從而得到一條熒光擴增曲線，利用熒光信號積累強度的變化實時監測整個PCR進程，在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，最后在這一階段通過Ct值和標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR技術中有兩個非常重要的概念：熒光閾值和Ct值。熒光閾值是指在熒光擴增曲線指數增長期設定的一個熒光強度標準，一般這個閾值是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光基礎信號，熒光閾值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差10倍，如果檢測到的熒光信號超過閾值才被認為是可信的信號。而在PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到熒光閾值時所經歷的擴增循環數被稱為Ct值，C代表循環（Cycle），T代表閾值（Threshold）[10]。對于Ct值與起始模板量關系的研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上得到該樣品的起始拷貝數[11]。

1.3 實時熒光定量PCR的特點

實時熒光定量PCR與傳統PCR相比，它具有諸多優點：⑴ 定量原理獨特，用產生熒光信號的多少來顯示擴增產物的量，實現了動態實時連續熒光監測，可視性強；⑵ 不需要PCR反應后的處理，而且只須在加樣時打開一次蓋子，大大降低了污染的可能性；⑶ 可以在很大濃度范圍內(>10倍）進行定量，有較高的靈敏度、特異性和精確性；⑷ 既可以做定性分析又可以做定量分析[13～14]。同時該技術也與傳統的PCR技術相比還有其不足之處：⑴ 由于減少了擴增后電泳的檢測步驟，因此不能監測擴增產物的大小。⑵ 在標準曲線定量中，由于沒有統一標準，各實驗室所用的生成標準曲線的標準樣品各不相同，致使試驗結果缺乏可比性；⑶ 試驗成本太高，也限制了其的應用范圍；⑷ 由于該技術極其靈敏，所以對實驗操作的精確度要求較高。

2 實時熒光定量PCR的分類

根據熒光基團標記和實現能量共振轉移方式的不同，目前實時熒光定量PCR應用比較廣泛的為四大類，分別是熒光染料（SYBR Green）、水解探針（Tapman）、雜交探針、分子信標，除此以外還有熒光標記引物，復合探針法，Lighf-uP、Cyclicons、LUXt、Scorpion、Amplifluor等[15～17]。

2.1 熒光染料（SYBR Green）

SYBR Green是一種能與dsDNA特異結合的染料，在PCR反應體系中，加入過量SYBR Green，SYBR Green特異地與dsDNA結合，發出熒光信號[18]。DNA結合染色的方法不需要使用特異性熒光標記的探針，相對簡便，同時也降低了檢測的成本，其特異性完全由PCR的引物所決定。其主要不足是：染料與DNA雙鏈分子的結合是非特異性的，它可以和反應體系中所有DNA分子結合，易受到非特異性擴增和引物二聚體的影響，產生熒光干擾，實驗容易產生假陽性信號，使定量結果不可靠。不過目前可以用熔解曲線分析來區分特異性和非特異性擴增，引物的設計和反應條件的優化對消除非特異性熒光也有很大幫助。

2.2 水解探針（Tapman）

目前在實時熒光定量PCR技術中應用較多的水解探針是Tapman探針。探針5’端標記一個熒光基團，3’端一個淬滅基團。探針完整時熒光基團和淬滅基團發生熒光共振能量轉移（FRET），所以檢測不到該探針5’端熒光基團發出的熒光。在PCR擴增過程中，由于Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針的熒光基團切下，熒光基團與淬滅基團遠離，不能發生FRET而產生熒光信號，每擴增一條DNA鏈就有一個游離的熒光分子形成，可通過檢測系統觀察到信號的變化，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。利用標準品模板系列繪制出標準曲線，結合各樣品的Ct值，可確定樣品的起初模板量[19]。美國ABI公司推出另外一種水解探針為Tapman-MGB探針，它與Taqman探針相比能更好地穩定探針與模板的雜交，升高探針Tm值[20]，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值，簡化了探針的設計，更有益檢測單堿基突變。另一個優點就是由于其長度短于Taqman探針，熒光和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，而使熒光背景更低。

2.3 雜交探針（Hybridization probe）

雜交探針技術主要是使用兩個特異的探針，其中上游的探針的3’端標記供體熒光基團，而下游的探針的5’端標記有受體熒光基團。在PCR模板退火階段，兩探針同時與目的基因發生頭尾結合形式的特異性結合，使供體和受體熒光基團距離非常接近，兩者產生熒光共振能量轉移，使得受體熒光基團發出熒光，當兩探針處于游離狀態時，無熒光產生。由于反應中運用了兩個探針，因此增加了方法的特異性，但兩個探針結合于模板上影響擴增效率。

2.4 分子信標（Molecular beacons）

分子信標技術是在同一探針的兩末端分別標記熒光基團和淬滅基團，為一種標記熒光的發夾探針。在未與模板發生雜交前該探針分子呈發夾結構，結合在其兩端的熒光基團距離上接近，產生能量轉移效應，不發生熒光。當該探針與模板雜交，使熒光基團與淬滅熒光基團彼此在空間上產生足夠的分離，熒光基團脫離了淬滅基團的影響，從而產生可被檢測到的熒光。熒光的強度與溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析[21]，若目標DNA序列同分子信標不能完全配對，雜交過程和信號不會出現。若在發夾結構中熒光標記物不能緊靠淬滅基團，會產生很強的背景信號。若分子信標內雜交過強，會妨礙同目標DNA分子的雜交，使得熒光信號不能充分釋放。最佳的分子信標應有合適的熔鏈特性。分子信標可檢測單個核苷酸的突變，適于SNP分析和等位基因突變分析。但設計較難，既要避免產生強的背景信號，又要避免莖部雜交過強，影響其與模板退火，從而影響熒光生成。

3 實時熒光定量PCR的定量方法

在實時熒光定量PCR中，有兩種定量模板的方法：絕對定量和相對定量。絕對定量指用已知的標準曲線來推算未知的樣本量；相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化[22]。

3.1 相對定量

相對定量指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化。此方法與絕對定量的標準曲線法基本相似，不同之處是未知樣品的量是相對于某個參照物的量而言。因此，相對定量的標準曲線比較容易制備，對于所用的標準品只需知道其稀釋度即可。

3.2 絕對定量

絕對定量指的是用已知的標準曲線來推算未知的樣本的量。此方法標準品的量是預先已知的。將標準品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。對未知樣品進行定量時，根據未知樣品的Ct值，即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數。質粒DNA和體外轉錄的RNA常作為絕對定量的標準品。

3.3 比較Ct法的相對定量

即△Ct值法，此方法是同時擴增待測靶基因片段和一個作為內參照的基因片段，一般是一個內源性管家基因片段。通過測兩者的Ct值之差（△Ct），比較不同待測標本DNA的△Ct值與正常標本DNA的△Ct值的變化，可對未知標本靶基因的原始拷貝數作出判斷。

4 實時熒光定量PCR技術在植物害蟲方面的應用

目前，實時定量PCR技術應用于植物害蟲鑒定、防治等研究相對其他領域較少，但該技術在植物害蟲、植物病原線蟲和害螨研究中已經顯示出了極好的應用前景。

4.1 在植物害蟲鑒定及檢測研究中的應用

傳統的植物害蟲鑒定方法依賴于形態特征和寄主范圍等特征來區分，但是對于一些植物害蟲之間的區分比較困難，尤其是檢疫性植物害蟲實蠅類，薊馬類等，而實時定量PCR技術是解決這一問題的可靠手段。余道堅[23]應用TaqMan探針和SYBR Green實時熒光PCR技術，分別建立了兩種快速鑒定重要檢疫性害蟲辣椒實蠅（Bactrocera latifrons）的方法。同時余道堅等[24]還應用SYBR Green實時定量熒光PCR技術，分別建立了SYBR Green實時熒光PCR快速鑒定菲立濱實蠅（bactrocera philippinensis）和芒果實蠅（bactrocera occiptalis）的方法。實現了對檢疫性實蠅快速準確的鑒定。徐浪等[25]應用TaqMan實時熒光定量PCR方法，實現了對形態學方法很難鑒別的大洋臀紋粉蚧（Planococcus minor）和南洋臀紋粉蚧（Planococcus lilaciu）進行準確鑒定，從而達到快速鑒定檢疫性粉蚧的目的。K.Walsh等[26]利用TaqMan實時熒光定量PCR技術，建立了快速鑒定重要檢疫性害蟲南黃薊馬（Thrips palmi）的方法。K.S.Huang等[27]也應用TaqMan實時熒光定量PCR技術建立了快速鑒定重要檢疫性害蟲西花薊馬（Frankliniella occidentalis）的方法。

另外，實時定量PCR還可以用來檢測土壤中的害蟲。KAREN HERBERT等[28]利用TaqMan熒光定量PCR技術，結合土壤DNA的提取，對土壤中葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae）若蟲進行了檢測，表明實時熒光定量PCR在檢測土壤中植物害蟲和監測種群動態變化方面具有很好的前景。

4.2 在植物害蟲生理研究中的應用

實時熒光定量PCR技術在植物害蟲生理研究中也有很好應用前景。崔旭紅等[29]利用TaqMan-MGB探針和特異性引物構建了B型煙粉虱（Bemisia tabaci）hsp70實時熒光定量RT-PCR檢測體系，對HSP70在B型煙粉虱抵抗高溫脅迫中的作用進行研究。翟會芳等[30]也構建了實時熒光定量RT-PCR體系，研究了HSP90在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲抗高溫中的作用。證明了該技術是研究植物害蟲抗逆性和相關基因表達的理想工具。Kanako Komaki等[31]利用實時熒光定量PCR和熒光測定法對各蟲態豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）細胞內共生細菌（Buchnera）的基因拷貝數進行了研究，證明了該技術是研究植物害蟲體內共生菌變化的靈敏工具。

4.3 在植物害蟲防治研究中的應用

實時熒光定量PCR植物害蟲防治研究中也有出色的表現。Lei等[32]利用實時熒光定量PCR技術對酚氧化酶原-2（PxPPO2）在小菜蛾（Plutella xylostella）不同蟲態中的轉錄量進行研究，可以通過降低PxPPO2的轉錄水平開發新型性殺蟲劑。張清平等[33]利用基于綠僵菌rDNA基因片段設計的PCR引物對、優化的DNA制備方法以及熒光定量PCR技術，對早期東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis）體內的病原真菌DNA進行簡便、快速、靈敏、準確的檢測，并確定病原真菌在其內的增殖速率和動態變化。楊和平等[34]利用熒光定量PCR技術檢測了甜菜夜蛾病毒殺蟲劑中甜菜夜蛾核型多角體病毒有效含量。證明了熒光定量PCR技術可以用于殺蟲劑有效生物含量的測定。James A.Anstead等[35]利用實時熒光定量PCR技術建立了準確檢測導致桃蚜（Myzus persicae）對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗藥性的兩個基因突變位點L1014F（kdr）和 M918T（super-kdr）。Y.P.Chen等[36]利用實時熒光定量PCR對舞毒蛾（Lymantria dispar）被刻絨繭蜂（Glyptapanteles indiensis）寄生后不同時期不同組織中的GiPDV 1.1的表達量進行檢測，證明該方法是一種可用于基因表達分析很好的工具。

4.4 在植物病原線蟲和螨類研究中的應用

近年來，實時熒光定量PCR技術也開始的應用于植物病原線蟲和害螨的研究，并獲得很好的研究成果。王焱等[37]分別用特異性引物法、ITS-PCR-RFLP法和實時熒光PCR法對松材線蟲進行了檢測，結果表明實時熒光PCR法耗時短，靈敏度高，適合用于松材線蟲的檢驗檢疫。國內外多篇文獻均有報道了應用實時熒光定量PCR技術，不僅能快速、準確的對松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）進行鑒定，也能夠對線蟲進行定性和定量分析[38～41]。王明旭等[42]利用松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（B．mucronatus）的rDNA-ITS2種間差異顯著特性，設計TaqMan探針，用實時熒光PCR的檢測方法能準確地區別2種線蟲。Berry等[43]建立了爪哇根結線蟲（Meloidogyne javanica），玉米根腐線蟲（Pratylenchus zeae）和桑大型針線蟲（Xiphinema elongatum）的實時熒光定量 PCR檢測方法，對寄生甘蔗的三種線蟲實現了靈敏，準確的檢測和定量。王翀等[44]設計鱗球莖莖線蟲（Ditylenchus dipsaci）特異的TaqMan 探針，建立了實時熒光 PCR 檢測方法。賀俊飛等[45]利用實時熒光定量PCR檢測中華卵索線蟲（Ovomermis sinensis）體內tra-1基因表達量，研究tra-1基因在中華卵索線蟲雌性生殖系統的發育、卵的形成以及胚胎的發育中的調控作用。Madani等[46]利用SYBR Green實時熒光定量，對馬鈴薯胞囊線蟲（Globodera pallida）以及甜菜胞囊線蟲（Heterodera schachtii）進行檢測和定量。Zhang等[47]利用實時熒光定量 PCR定量檢測潛在植物寄生線蟲生防菌-洛斯里被毛孢子的種群密度，研究食線蟲真菌的DNA量和被寄生線蟲的百分比之間的關系，并可結合生物測定監測土壤真菌的生物量和活性效果。李明等[48]運用real-time PCR分析冷激和熱激后HSP70基因TCHSP70-4在朱砂葉螨體內的表達量，對朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus（Boisduval））熱激蛋白HSP70的表達與其適應高溫和低溫脅迫的關系進行了研究。

5 小結

實時熒光定量PCR技術是近年來發展起來的新的檢測方法，與常規RT-PCR相比具有明顯優越的靈敏度、特異性、穩定性和操作簡便的特點，但仍有些問題需解決，如自動化儀器﹑試劑及其檢測的成本等。近些年來，實時熒光定量PCR技術還廣泛應用于植物營養學研究、植物發育學研究、植物抗逆機理研究、轉基因植物的檢測、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉導、環境對植物基因表達的影響等方面[49]。在植物病蟲害研究的許多領域顯現出它的優越性，并開始被廣泛應用。

許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對熒光PCR技術進行不斷深入的研究和改進，使熒光PCR技術得到了進一步的完善，并在此基礎上開發出了許多新的實時熒光定量PCR技術。而實時熒光定量PCR技術與生物基因芯片技術結合會使FQ-PCR技術進一步完善，可提高其在生命科學領域的應用范圍和普及程度，FQ-PCR將成為未來植物害蟲研究的必備工具，在植物保護領域將得到更加廣泛的應用。

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致謝：承蒙中國農業科學院植物保護研究所馮潔研究員審閱、修改本文。