超高效液相色譜的七年之癢：未來在何方

Robert STEVENSON

在2004年的匹茲堡會議上，Waters公司(Milford,MA)介紹了一種能夠承受最高壓力為15 000 psi的ACQUITY UPLC色譜儀，從而導致生產色譜儀器的其他公司不得不加快步伐追趕。隨著他們的競爭，造成的后果包括引起憂慮、不確定性和懷疑(FUD)。然而直到2010年春季，市場上最大的7家供應商每一家都才分別推出可以與之競爭的儀器，其中一些儀器的最大壓力超過5 000 psi。而對于使用者來說，受益是實實在在的，并且經常帶來比預期更有價值的利益。很多關于銷售的爭論已經拋諸腦后。因此，讓我們看看在七年之后UPLC會在未來帶來什么。

首先讓我們來看看使用者所認知的來自超高效液相色譜(UHPLC)技術的好處。分析的速度和通量上的直接改進是很明顯的，并且這是可以預期的結果，但是還有更多的好處。由于峰寬減小和標準分析柱的直徑減少(從4 mm到2 mm甚至到更小)，檢測靈敏度提高了好幾倍。大多數早期的儀器使用者，并沒有預見到由于工作流程和分析速度的改進會使效率有很明顯的提高。用戶發現在很多情況下，接近實時或是實時的結果會幫助決策的制定。這在生產層面是決定性的。Waters公司很快就發展在過程層面上的ACQUITY，對象是擁有ACQUITY PATROLTM的實驗室。盡管采用新技術和工作流程的程序設置比較慢，但是PATROL色譜儀正在迅速地得到關注，尤其是對醫藥品生產的支持。毫無疑問，美國食品和藥品管理局(PDA)主動推廣的過程分析技術(PAT)正在起著積極的作用。

人們通常關注的一個問題是：傳統方法能夠過渡到UHPLC上嗎？答案是依情況而定。如果這個方法包括等度洗脫，流速是通過與柱內徑的比例簡單地下降，它保證了線性速率相同。通過柱長的變化比例減少運行時間，同時還需要檢查數據系統通過比較臨界峰對之間的分辨率來處理窄峰的能力。在大多數情況下，所有上述情況非常簡單。最多也就是創建一個新的保留時間表。如果需要更高的可信度，可以對兩個儀器進行可能一個月的平行實驗，對結果進行比較，結果應該是一致的。

對于梯度洗脫，系統死體積是不一樣的。例如，Agilent (Wilmington, DE)推出的Jet Weaver混合器有10到35 μL的死體積，其依賴于所混合體系的成分。這個死體積(混合)是大大小于1100系列液相色譜儀的死體積，所以梯度斜率比一般的(1100)混合器陡峭得多。大多數供應商已經實現通過計算機來轉換色譜方法，并且考慮到了流速設置的改變。DryLab(Molnar Institude,Berlin,Germany)也擴展了這項功能，其中還包含耐用性評價。

盡管如此，如果構建的方法不好，在過渡過程中可能就會有很大變化以至于需要新的研究來進行確認。實際上，Agilent已經考慮到從1260和1290與更老型號儀器的連接程序包。例如，如果在Agilent 1100系列儀器上有一個經過驗證的方法，1290就能夠被“解調諧”給出與1100儀器相類似的性能。通過新舊儀器的比較，然后就能夠得到相應的結果(保留時間和臨界峰對的分辨率)。通過在適當的位置從1100連接到1290儀器平臺，就很容易通過改變方法達到利用1290儀器潛在性能的目的，或者更簡單的，只用一個梯度控制來減少其斜率。至少在一些情況下這種運行模式的效果非常好。

另一個問題是：是否所有HPLC模式都能轉變到相應的UHPLC。對于反相液相色譜(RPLC)是沒有任何問題的。因為RPLC大約占了市場的三分之二，因此這是一個開始轉變的基礎。正相液相色譜，包括親水作用液相色譜(HILIC)，也可以進行轉變。對于離子交換和體積排阻色譜的答案就沒有那么清楚的證明。一般的離子色譜應該行得通，但是關于免試劑模式有很多的問題，在這里膜受到很高的壓力。膜的機械完整性是一個需要考慮的因素；除此之外壓力能引導滲透流到高濃度的一邊，這也是需要控制的。

超高壓帶來的樣品兼容性也是一個需要考慮的因素。超高壓對于小分子來說沒有什么關系，但是蛋白質和聚集體在很高的壓力下結構會發生變化[1]。蛋白質聚集體在2 000 bar的靜水壓下就能夠分解。對于其中一部分來說甚至在更低的壓力下就會開始裂解。進一步說，蛋白質的折疊也對壓力敏感。高靜水壓可以展開蛋白質，因此暴露了其與三級結構相關的疏水端。RPLC中的填料由于對疏水區域有親和作用，會改變蛋白質解折疊的熱力學。更糟糕的是，當蛋白質被送到柱內，其構型也會隨之變化。最高的壓力在柱的入口，如果壓力足夠高，蛋白可能開始解折疊，暴露了一般難以見到的與固定相相互作用疏水端，但是在出口附近，壓力小得多，這就允許蛋白質部分或是全部地重新折疊。這種在柱內的分析物構型的改變，當然會得到非理想形狀的色譜峰。通過在線快速搜索，我找不到任何關于高壓流動相在色譜分離過程中對蛋白質結構的影響的報告。盡管如此，如果高的壓力最后證明對于大蛋白質的分離有一定影響，那么也許可以采用場流分離彌補其缺陷。

1 其他因素

短的柱壽命也是一個經常關注的問題。用于UHPLC的柱子一般的定價是比傳統儀器上的柱子高20%或更高。通過比較用于UHPLC的一個2.1 mm內徑的色譜柱和傳統儀器的一個類似固定相的4 mm內徑的色譜柱，早期的對UPLC的質疑指出UPLC柱子不像一般柱子具有很長的使用壽命。Waters公司對此的反擊是認為這種情況可能只是偶然發生的，但是在其使用期限內，UPLC柱子由于短的運行時間所以可能會運行了很多的樣品。因此，這兩種情況都可能是真的。我曾很有限地與一些UHPLC使用者交談，他們很少認為柱壽命是UHPLC需要考慮的問題。

如果對于樣品來說，短的柱壽命是一個需要考慮的因素，那么一些供應商建議用0.2 μm的濾膜過濾流動相和樣品。這會除去一般可能會堵住柱子的微粒。大多數的供應商有用于過濾流動相的和樣品的配件。

配件是另一個需要考慮的因素。最初，配件是UPLC儀器中的一個很明顯的弱點。套管可能滑動，這將會導致管道拉回或是在極端情況下從配件中拉出。幸運的是，后者是很少見的，但是套管的移動的確存在。不過柱效的損失是容易發現并彌補的。現在，一些廠商利用新的設計已經解決了這個問題。Dionex公司(Santa Clara, CA)推出了這種ViperTM配件，它通過獨特的設計提供了一個可靠的連接。Optimize Technologies公司(Oregon City, OR)推出了一個新的雙套管，只需要用手擰緊就可以使其咬住管壁。

Shimadzu Scientific Instruments公司(Columbia, MD)介紹了一個在Nexera的HPLC進樣器中所加入的新的omega流路，該流路保證了進樣閥密封面的平整性。相對而言，傳統的設計對于系統壓力來說有三分之一在轉子密封處，但是其余的都在周圍。這可能使密封面傾斜和增加磨損，并最終導致滲漏。

2 花費

許多人都受UHPLC的所承諾的性能吸引，但是它的成本如何？既使在這里，甚至在這一點上，改變也是顯而易見的。對于大多數人來說，這依賴于進樣量。一個6 000 psi的儀器和一個UHPLC儀器，它們的價格差別在40%到100%左右。但是Dionex的Frazer McLeod聲稱[2]，其通量上的效率增加了10倍。通常來說，效率的提高是決定于進樣量。一般來說，當實驗室需要更高的分析容量時，就要增加一套HPLC。一次性增加10倍通量是很少見的。但是如果你有這樣一套UHPLC儀器，花費是很少的和引人注目的。一套UHPLC儀器比10套傳統的色譜儀器要便宜得多。

PerkinElmer (PE, Shelton, CT)公司的Eric Denoyer博士對PE公司不同儀器間的對比經濟學分析表格進行了討論，涉及的儀器主要是PE改進的Flexar FX-10 (10000psi)、FX-15 (15000psi)HPLC系統和一般的HPLC系統如PE200系列HPLC[3]。實驗室在幾個月之內得到進樣量的回報證明相對于其增加的成本是值得的。

同時PE公司的分析節省了溶劑，但似乎忽略了實驗室空間的消耗。工作臺所需要的空間一般是非常缺乏的，而且十分昂貴的。UHPLC的高通量特點可能會代替一些傳統儀器，從而為其他的工作騰出了空間。Dionex公司推出了一個雙梯度的方法，它與單個梯度的覆蓋區域是類似的。

另外一種情況是如果HPLC儀器使用很少并且從來不運行到它的檢出限，那么通過對成本分析建議使用傳統的系統(6 000psi)。制備色譜，甚至是實驗室規模，可能一直傾向于使用常規HPLC技術來進行分離純化。

3 UPLC往何處去？

UPLC的未來怎么樣呢？UPLC的發展是通過柱技術推動的。如果我們接受更高的壓力，那么可以使用更長的柱子，以得到更高的峰容量，這對于分離來說是有用的。當然，可以放棄使用小粒徑的填料(比如說10 μm的填料)而制作長的柱子以達到高峰容量，但是太長的運行時間并不符合我們的要求。有趣的是，需要高峰容量的樣品的數量是非常少的，至少在今天看來。并且比起簡單地使用長的柱子，多維液相色譜可能是一個更加有效地增加峰容量的途徑。

減少柱子填料的粒徑是另一種選擇。然而，在工程上會遇到很大的挑戰，比如說流動相的壓縮。我們已經知道大概三分之一的泵沖程被用于壓縮流動相到20 000 psi。現今的脈沖阻尼器(機械上和電氣上的)是非常有效的，但是往復式計量泵在運行的時候會達到臨界的狀態。因此，最大壓力的增加可能將需要一個不同的泵技術，也許是小體積注射泵。

就個人而言，我對UHPLC接下來10年改進的期望：由于色譜儀器產品壽命周期是大約10年，下一代的UHPLC應該在1或2年之內開始出現。我期待的改進是最大壓力將會慢慢的增加到35000 psi左右。泵在最高壓力工作的能力也會導致流速范圍的增加。我們發現最小尺寸在1.4~2 μm的柱填料在10年內都會比較實用。由于在30 000 psi左右的情況下需要避免摩擦熱的產生，柱直徑將會優化小于1 mm。預填充柱長度的選擇將會變長。盡管如此，不同于現今通過對柱的需求來帶動它的發展，這些改進將會給柱子帶來新的應用。這是一段艱苦的路程。

總而言之，Waters公司因抓住了機遇受到贊賞，用UPLC技術將HPLC帶到一個新的水平。在大約40 000 psi提高150%的性能對于開啟新領域研究來說其價值并不明顯。似乎更可能地是工程師在下一個或兩個產品周期將會集中提高(臨界狀態)的性能。隨著單位體積和工程經濟學的改進，花費將會降低。

[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC113776/.

[2] McLeod, F.UHPLC + Solutions from Dionex.Lecture in Webinar, Nov 18, organized by Lab Manager; http://www.labmanager.com/articles.asp?ID=817.

[3] Denoyer, E.UHPLC + Solutions from Dionex.Lecture in Webinar, Nov 18, organized by Lab Manager; http://www.labmanager.com/articles.asp?ID=817.