反相高效液相色譜法測定虎杖根中白藜蘆醇及其苷的含量

鄒盛勤

（宜春學院化學與生物工程學院，江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西 宜春 336000）

虎杖( polygonum cuspidatum siobet Zucc.) 為蓼科屬多年生草本植物的根或根莖，在我國大部分地區廣泛分布。虎杖性味微寒微苦，歸肝、膽、肺經，具有活血定痛、清熱利濕、止咳化痰作用。近年來，國內外學者對虎杖的化學成分、藥理作用、提取分離做了許多研究，發現其根莖含有多羥基芪類化合物白藜蘆醇及其苷，屬于單寧質多酚[1]，對人體具有降血脂、抗血栓、預防動脈硬化、增強免疫功能等重要調節作用，是一種極具開發價值的天然物質[2]。據調查，目前市場上的藥材主要來源于江西、貴州、四川、江蘇、浙江等地區，主要含有蒽醌類化合物、白藜蘆醇及苷、水溶性多糖和鞣質等成分，在臨床上廣泛應用[3,4]。本文建立了同時測定不同根齡虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇的定量方法，為客觀評價虎杖的質量提供參考依據。

1 儀器和試藥

Waters HPLC儀(美國，515泵，2996光電二極管陣列檢測器，77251進樣閥，Empower中文色譜數據工作站)；SK2510HP超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司) ；RO-MB-10D高純水機(杭州永潔達膜分離設備廠)。甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司），其余試劑均為分析純，水為超純水。虎杖苷、白藜蘆醇對照品（Sigma公司）。虎杖根采自江西省宜春市，經鑒定為蓼科植物虎杖polygonum cuspidatum的根。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取虎杖苷和白藜蘆醇3.58 mg和3.70 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得含虎杖苷和白藜蘆醇0.358 mg/mL和0.370 mg/mL的對照品混合溶液，備用。

2.2 樣品溶液的制備

虎杖根與80℃下烘干8 h，粉碎過20目篩。精密稱取2.0 g虎杖根粉末于50mL容量瓶中，加入50 ml甲醇，稱重。超聲提取30 min，冷卻后補足損失重量，搖勻后用0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為樣品溶液。

2.3 檢測波長的選擇

采用PAD檢測器在190~400 nm波長范圍內掃描，虎杖苷在流動相中的最大吸收波長均為216.3和319.2 nm，白藜蘆醇在流動相中的最大吸收波長為216.3 和306.1 nm選擇319 nm為檢測波長，信噪比高，基線平穩，待測組分峰形對稱。虎杖苷和白藜蘆醇在流動相中的紫外吸收光譜見圖1

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流動相為甲醇∶1%磷酸水溶液（50∶50），流速為0.8 mL/min，檢測波長319 nm，柱溫30℃，采用外標法定量分析。虎杖苷和白藜蘆醇理論塔板數均大于3000，對稱因子分別為1.03、1.05。對照品及樣品色譜圖見圖2。

2.4 精密度試驗

分別精密吸取對照品混合溶液10 μL，平行進樣5次，以峰面積計算色譜系統精密度，虎杖苷和白藜蘆醇峰面積RSD分別為0.42 %(n=5)和0.56 %(n=5)。進樣方法和儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取對照品溶液分別于1，2，4，8，12，24 h進樣，按上述色譜條件測定峰面積。虎杖苷和白藜蘆醇峰面積的RSD分別為0.84%和1.14%。表明樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.6 重現性試驗

取同一虎杖根樣品5份，每份各約2.0 g，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液10 μL，進樣，測定其峰面積積分值，外標法計算含量，虎杖苷和白藜蘆醇含量的RSD分別為1.95 %(n=5)和1.62 %（n=5）。結果表明，樣品制備方法重現性良好。

2.7 線性關系考察

精密吸取對照品混合溶液各2.0，6.0，10.0，15.0，20.0 mL進樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品的進樣量(μg)為橫坐標，峰面積(μV·s)為縱坐標，繪制標準曲線，得虎杖苷回歸方程為：Y=3.02×105X-1.84×104（r=0.9996），線性范圍0.716~7.160 μg，LOD（檢測限）為0.92 ng，LOQ（定量限）為2.61 ng；白藜蘆醇回歸方程為：Y=3.40×105X-2.16×104（r=0.9998），線性范圍0.740~7.400 μg，LOD為0.85 ng，LOQ為2.17 ng。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的虎杖根樣品6份，每份約1.0 g，分別加入虎杖苷和白藜蘆醇對照品適量，按樣品制備方法制備樣品溶液，進樣測定含量，虎杖苷平均回收率為99.7 %，RSD為1.81 %（n=6）；白藜蘆醇平均回收率為98.5 %，RSD為2.02 %（n=6）。

2.9 樣品含量測定

取不同根齡虎杖根藥材，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，準確吸取20μL，進樣分析，平行測定3次，外標法計算各樣品中虎杖苷和白藜蘆醇的含量。樣品測定結果見表1。

表1 不同根齡虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 測定結果表明，不同根齡虎杖根樣品中白藜蘆醇及其苷的含量差異較大，虎杖苷和白藜蘆醇在根齡2~3年間含量均最高，虎杖苷的含量約為白藜蘆醇的4倍。提示虎杖根的最佳采收期為根齡2~3年，期間其主要活性物質芪類化合物及其苷總含量最高。

3.2 在樣品預處理時，保持其他提取條件不變，考察了提取次數對樣品中虎杖苷和白藜蘆醇提取率的影響。經測定比較，第2次提取液中虎杖苷的峰面積為第1 次提取液的2.46 %，白藜蘆醇的峰面積為第1次提取液的2.22%，可認為提取1 次后，虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇已基本提取完全。故樣品溶液的制備均采用甲醇超聲提取30 min。

3.3 本文建立了同時測定不同根齡虎杖根中的2種主要有效成分含量的反相高效液相色譜定量方法，虎杖苷和白藜蘆醇獲得基線分離，且具有快速、準確、重復性好等特點，可用于虎杖藥材的質量控制。

[1] 潘明新,王小陽.虎杖的化學成分及其藥理作用[J].中藥材,2000,23(1):56-58.

[2] 肖凱,宣利江,徐亞明,等.虎杖的化學成分研究[J].中國藥學雜志, 2003, 38(1): 12-15.

[3] 黃遠芬,李蓓蓓,羅霄山.虎杖及其有效成分藥理作用研究進展[J].廣東藥學, 2000,10(6): 13-15.

[4] 楊紅美,陳波,曾建國,等.HPLC同時測定虎杖及其提取物中4種有效成分的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(3):202-205.