白血病的分子生物學(xué)診斷研究進(jìn)展

張耀輝

(淄博市中心醫(yī)院，山東淄博，255036)

白血病是一類常見(jiàn)和多發(fā)的造血干細(xì)胞克隆性惡性疾病，形態(tài)學(xué)分型為其主要診斷方法，但對(duì)于一些形態(tài)不典型的病例易誤診。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)，大部分的白血病存在著某種染色體易位，而易位會(huì)產(chǎn)生新的融合基因、癌基因的擴(kuò)增、原癌基因點(diǎn)突變或抑癌基因的失活等。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白血病的基因診斷已成為研究熱點(diǎn)，現(xiàn)將其研究進(jìn)展綜述如下。

1 診斷策略

基因診斷是利用分子生物學(xué)的技術(shù)方法檢測(cè)受檢者體內(nèi)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)或者水平的變化，從而對(duì)疾病作出診斷的方法［1］。與傳統(tǒng)方法相比較，其具有非常顯著的優(yōu)越性，既可以直接對(duì)個(gè)體基因狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，又可以對(duì)表型正常的攜帶者以及特定疾病的易感者作出診斷和預(yù)測(cè)［2］。

在分子水平診斷白血病主要針對(duì)特定的染色體易位和易位形成的融合基因，如急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)M2b型存在AML1/ETO融合基因，為t(8;21)(q22;q22)易位所產(chǎn)生;M3型存在PML/RARα融合基因，是t(15;17)(q22;q21)易位所產(chǎn)生的;慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)存在的bcr/abl融合基因由t(9;22)(q34;q11)易位所產(chǎn)生的;急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)則存在IgH、TCRγ、TCRδ等基因重排。髓系細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病的重排基因以及融合基因?yàn)榉肿由飳W(xué)診斷白血病提供了分子靶標(biāo)，使其能有效進(jìn)行白血病的分型診斷、微小殘留病(MRD)的監(jiān)測(cè)及療效評(píng)價(jià)［3］。

2 診斷方法

2.1 熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 目前FISH廣泛用于檢測(cè)染色體重組和標(biāo)記染色體，檢測(cè)多種基因疾病的染色體微缺失和用于非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷［4，5］。其基本原理是用標(biāo)記了熒光素、生物素或者地高辛的單鏈DNA探針和與其互補(bǔ)的DNA退火雜交，通過(guò)檢測(cè)附著在玻片上的分裂中期或間期細(xì)胞上的核DNA位置反映相應(yīng)基因的狀況。適用于多種臨床標(biāo)本(如血液、骨髓、組織印片和體液，甚至石蠟包埋的組織標(biāo)本等)，具有直觀、方便、敏感、可量化、方法多樣和適應(yīng)不同檢測(cè)目的等優(yōu)點(diǎn)，目前在血液學(xué)領(lǐng)域中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，尤其是在白血病診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估和微小殘留病檢測(cè)等諸方面為不可缺少的重要手段。

目前，可通過(guò)檢測(cè)已經(jīng)被克隆的染色體易位累及的融合基因?qū)Π籽∵M(jìn)行分子診斷。常見(jiàn)的單一序列探針有PML/RARα、AML1/ETO、BCR/ABL和 TEL/AML1等。但是為了方便起見(jiàn)，商品化的探針可為多標(biāo)記的，即兩個(gè)基因分別用兩種顏色進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)在一張玻片標(biāo)本上進(jìn)行雜交，可大大提高檢測(cè)效率。間期FISH技術(shù)檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞水平上的染色體異常，可提供白血病負(fù)荷的數(shù)量指標(biāo)，且可反映各期細(xì)胞的白血病殘留狀態(tài)，因此在國(guó)際上被廣泛運(yùn)用。杜慶鋒等［6］應(yīng)用雙色雙融合間期熒光原位雜交(D-FISH)探針對(duì)移植后或經(jīng)供者淋巴細(xì)胞輸注治療獲完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解的慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓內(nèi)殘留的微小腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示D-FISH具有很好的靈敏度及特異性，可重復(fù)性高，并且檢測(cè)到的陽(yáng)性結(jié)果與RT-PCR結(jié)果高度相關(guān)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RQ-PCR)RQ-PCR技術(shù)是在常規(guī)的PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光標(biāo)記探針，然后通過(guò)熒光定量PCR儀檢測(cè)PCR過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化情況，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值(即PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù))來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其具有靈敏、特異、技術(shù)成熟和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)白血病融合基因結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，對(duì)于臨床上明確診斷、具體分型、動(dòng)態(tài)觀測(cè)腫瘤負(fù)荷、選擇合適治療方案、評(píng)估治療效果和預(yù)后都有較大價(jià)值。姜艷梅等［7］對(duì)RQ-PCR進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，在應(yīng)用其檢測(cè)急性髓系白血病AML1/ETO融合基因時(shí)，結(jié)果顯示6例陰性AML1/ETO融合基因標(biāo)本均呈現(xiàn)陰性，說(shuō)明其特異性好，可重復(fù)性高。Uckun等［8］在用不同方法檢測(cè)ALL患兒的t(4;11)染色體易位時(shí)發(fā)現(xiàn)，RQ-PCR既具有較核型分析和巢式RT-PCR更高的敏感性，又可定量分析。

2.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是將大量探針有序地固定在固相支持物上，與待測(cè)樣本中的多種類核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行雜交，再通過(guò)電子計(jì)算機(jī)控制點(diǎn)樣和圖像掃描硬件及軟件分析，迅速得出待測(cè)樣本生物信息的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)果的方法。其優(yōu)越性為能夠在基因表達(dá)水平上對(duì)腫瘤進(jìn)行更精確的分型分類，并可預(yù)測(cè)腫瘤的治療效果和預(yù)后。

隨著人類基因組測(cè)序的完成，借助基因芯片技術(shù)，目前可得到不同類型腫瘤的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)譜(GEP)。近年來(lái)，應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行白血病的GEP研究報(bào)道較多，但用于臨床診斷的基因芯片尚未問(wèn)世，仍處于研究探索階段。目前一個(gè)國(guó)際性腫瘤合作研究組(MILE)正在對(duì)基因芯片在白血病診斷分型方面的可靠性、敏感性和特異性進(jìn)行評(píng)估，其有望改變白血病的診斷和分類格局，甚至成為白血病分子分型的必備工具［9］。

綜上所述，F(xiàn)ISH、RQ-PCR或基因芯片檢測(cè)融合基因和基因重排，可用于白血病和微小殘留病(MRD)分子生物學(xué)監(jiān)測(cè)，在惡性血液病診治中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，尤其對(duì)一些骨髓形態(tài)學(xué)檢查并不十分典型的白血病，通過(guò)檢出其特征性染色體的改變，可提高疾病的診斷率。白血病的分子生物學(xué)診斷既可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)(M)、免疫學(xué)(I)和細(xì)胞遺傳學(xué)(C)檢查的不足，又能夠發(fā)現(xiàn)新的亞型。白血病相關(guān)基因的分子生物學(xué)檢測(cè)不僅診斷達(dá)到分子水平，而且可以了解患者的白血病細(xì)胞負(fù)荷情況，并及時(shí)制訂合適的治療方案，極具臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］府偉靈.基因診斷治療與預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(1):24-25.

［2］Zechi-Ceide RM，Jesus-Oliveira NA，Guion-Almeida ML，et al.Clinical evaluation and COL2A1 gene analysis in 21 Brazilian families with Stickler syndrome:identification of novel mutations，further genotype/phenotype correlation，and its implications for the diagnosis［J］.Eur J Med Genet，2008，51(3):183-196.

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［7］姜艷梅，袁宏，劉新光，等.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)急性髓系白血病患者AML1/ETO融合基因的臨床意義分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2009，17(1):17-22.

［8］Uckun MF，Herman-Hattenk K，Crotty LM，et al.Clinical significance of mll-afl fusion transcript expression in the sbsence of a cytogenetically detectable t(4，11)(q21，q23)chromosomal translocation［J］.Blood，1998，92(3):810-821.

［9］Haferlach T，Kohlmann A，Bacher U，et al.Gene expression profiling for the diagnosis of acute leukemia［J］.Br J Cancer，2007，96(4):535-540.