熒光定量PCR對兒童肺炎支原體感染早期診斷和臨床意義

張永峰，王永芹

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261031)

肺炎支原體(MP)是小兒呼吸道感染的常見病原體之一，并有逐年上升趨勢。2007年3月～2009年3月，我們采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)法對320例肺炎患兒集咽拭子、血等標(biāo)本進行檢測，探討熒光定量PCR對兒童肺炎支原體感染的早期診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 肺炎患兒320例，男174例，女146例;年齡3個月～14歲，平均4.8歲。間接免疫熒光法檢測咽拭子呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒、流感病毒等常規(guī)病毒抗體均為陰性，依據(jù)第7版《實用兒科學(xué)》的標(biāo)準(zhǔn)。雙份血清抗體4倍以上升高或單次血清抗體滴度≥1∶160作為肺炎支原體感染診斷標(biāo)準(zhǔn)。急性期238例，其中輕癥(肺部體征輕，胸部X線表現(xiàn)為支氣管肺炎改變或間質(zhì)性肺炎改變或大葉性肺炎單葉受累)187例，重癥(肺部體征明顯，有實變體征，胸部X線表現(xiàn)為大葉性肺炎改變，兩個肺葉受累或有胸水和或有肺外并發(fā)癥)51例;恢復(fù)期82例。

1.2 檢測方法 患兒入院后24 h內(nèi)和恢復(fù)期行標(biāo)本采集，用無菌生理鹽水棉拭子直接擦拭咽后壁，浸于1 ml無菌生理鹽水中震蕩，密封冰盒運送，－20℃保存，采用實時熒光定量基因擴增儀(FTC-2000A)測定MP-DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作;病程第5～7天及相隔1～2周采集靜脈血，采用微量顆粒凝集法測定MP抗體;熒光定量PCR法測定血MP-DNA，結(jié)果判定:閾值之上出現(xiàn)擴增曲線，Ct值＜38為陽性，由儀器自動算出DNA含量(基因拷貝數(shù)/ml);Ct值＞40為陰性，38～40為灰區(qū)，建議復(fù)查。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

320例患兒中微量顆粒凝集法陽性116例，陽性率為36.3%;熒光定量PCR法陽性有108例，陽性率為33.8%;兩種方法均陽性96例，均陰性192例，符合率為91.8%。兩種檢測方法無統(tǒng)計學(xué)差異。320例患兒中，微量顆粒凝集法首次血清抗體＜1∶160的有204例，采集二次血清檢測抗體，雙份抗體呈4倍增高者35例，熒光定量PCR法32例為陽性。雙份抗體增高不足4倍者169例，其中熒光定量PCR法亦為陰性者154例，二者符合率為90.12%。咽拭子和血標(biāo)本中MP-DNA陽性率分別為33.8%、18.8%，MP-DNA 拷貝量分別為(3.70 ±0.44) ×102、(4.36 ± 0.53) × 103copy/ml，兩者比較P均＜0.01。重癥患兒血液及咽拭子MP-DNA的拷貝數(shù)分別為(8.53±2.27) ×102、(3.25±1.61) ×103copy/ml，輕癥患兒分別為(3.31 ±1.51)×102、(2.92 ±1.76) × 103copy/ml，兩者比較 P 均＜0.01。MP感染患兒急性期血液、咽拭子MP-DNA的拷貝數(shù)分別為(4.61±2.85) ×102、(4.08±2.65) ×103copy/ml，治療 2 周后分別為(1.30 ±1.43) ×102、(0.95 ± 0.73) × 103copy/ml，P 均 ＜0.01。

3 討論

肺炎支原體肺炎臨床表現(xiàn)多不典型，早期不易作出診斷。血清學(xué)MP-IgM檢查有一定的靈敏性、特異性，但特異性抗體高峰出現(xiàn)較晚，也有可能檢出持久存在的MP-IgM抗體;另外，重癥感染者可能不出現(xiàn)MP-IgM抗體，免疫功能低下的患者容易感染MP，感染后由于抗體產(chǎn)生不足、血清抗體不升高等原因，會造成免疫學(xué)檢測無效，特別是嬰幼兒，因而MP-IgM抗體檢測不宜作為惟一的診斷方法。FQPCR具有PCR技術(shù)的DNA高效擴增、探針技術(shù)高特異性和光譜技術(shù)的敏感性及定量分析優(yōu)點，在數(shù)小時內(nèi)可以及時地提供結(jié)果，完全密封式操作可明顯降低污染造成的假陽性，定量結(jié)果能夠客觀、適時地反映病情，故可作為肺炎支原體感染的早期診斷的有效方法［1］。

正常咽部極少有MP存在，故咽拭子MP檢測陽性可為確診提供保證［2］。另外幼兒咽部取樣方便，年長兒童亦可取痰等呼吸道標(biāo)本檢查。本研究發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR法與微量顆粒凝集法在檢測MP上無顯著性差異;204例首次抗體＜1∶160的患兒中，35例患兒經(jīng)微量顆粒凝集法對比雙份血清后才能診斷，而采用熒光定量PCR法入院時32例即能診斷，提示熒光定量PCR法與微量顆粒凝集法相比具有早期診斷的特點。

支原體可引起支原體血癥，直接侵犯各系統(tǒng)、組織引起病變［3］。國外報道從肺炎支原體呼吸道感染的病例血液中直接分離出肺炎支原體，提示肺炎支原體可進入血流，有在呼吸系統(tǒng)以外的部位增殖的可能性［4］。血PCR檢查發(fā)現(xiàn)MP可以侵入血液，為MP肺外直接侵犯提供了依據(jù)，推測MP感染均有不同程度的血液侵入發(fā)生，若達(dá)一定程度，則能被靈敏的PCR技術(shù)檢測出來。本研究血液標(biāo)本PCR陽性率低于咽拭子標(biāo)本，且MP-DNA平均拷貝值亦明顯低于咽拭子，提示僅部分肺炎支原體侵入血液中，引起支原體血癥。若依據(jù)血中MP的PCR檢查為是否MP感染的依據(jù)，有可能造成對MP感染的漏診，故不宜取血標(biāo)本檢查。本研究發(fā)現(xiàn)重癥患者血液MP-DNA的拷貝數(shù)明顯高于輕癥者，急性期咽拭子和血液MP-DNA的拷貝數(shù)亦明顯高于恢復(fù)期，證實MP-DNA的結(jié)果可用于判斷病情、評估療效、指導(dǎo)治療。

綜上所述，在MP感染急性期采用PCR法行咽拭子和血MP檢測，能明顯提高MP感染的陽性檢出率;早期正確診斷和合理治療可縮短住院時間和病程，減少并發(fā)癥，降低治療費用，而且，若結(jié)合血熒光定量PCR法MP-DNA的檢測，對肺炎支原體肺炎病情判定及治療效果評估具有很好的臨床應(yīng)用價值。

［1］孫紅妹.肺炎支原體感染實驗室診斷［J］.實用兒科臨床雜志，2007，22(4):245-247.

［2］侯安存，劉玉華，辛德莉，等.健康兒童鼻咽部常見致病微生物攜帶狀況及臨床意義［J］.中華兒科雜志，2002，40(1):45-49.

［3］鐘天鷹.熒光定量PCR法檢測呼吸系統(tǒng)感染兒童肺炎支原體DNA 的分析［J］.臨床兒科雜志，2002，20(3):137-139.

［4］Daxboeck F.Detection of Mycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasma pneumoniae by PCR［J］.Int J Med Microbiol，2005，295(4):279-285.