應激及其損傷時HSP70表達及調控機制

柳迎華，付青姐，李明春

應激反應及應激保護是近年來應激損傷領域研究的熱點。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類廣泛存在于動植物體內的，在進化上高度保守的蛋白家族。由應激誘導的熱休克蛋白可以保護細胞免受由應激所致的損傷。在細胞受到應激刺激或其損傷時，能夠迅速合成，對生物體細胞起到一定的保護作用。HSPs家族按其分子量及等電點可分為五個家族：低分子量HSP家族，中等分量HSP家族，HSP70家族，HSP90家族以及HSP110家族[1]。其中HSP70家族是結構上最為保守，對應激最為敏感的一類，被稱為主要熱休克蛋白，是HSPs家族中研究最為廣泛，最深入的一種。

1 HSP70的結構特征

1.1 HSP70的分類 HSP70是一類分子量在66～80 kD的熱休克蛋白，它們的分子量相近，等電點為pH5.2～6.3。HSP70家族在結構上高度保守，主要包括四種蛋白：HSP72、HSP73、HSP75、HSP78。 HSP72 為 誘 導 型 HSP70 （induced HSP70），在正常細胞中通常不表達或表達較少，在熱及其它應激原作用下表達迅速增加。HSP73為結構型HSP70（constitutive HSP70），也稱熱應激同源蛋白70（heat shock cognate 70），在所有的細胞內均能表達且受熱誘導，是哺乳動物細胞內的結構蛋白。HSP75，主要定位于線粒體內，參與細胞內合成線粒體蛋白質前體的跨膜轉運以及進入線粒體后的穩定和進一步折疊。HSP78，也稱葡萄糖調節蛋白，位于內質網和其它生物膜腔，可能與IgG的成熟和許多分泌蛋白分子的組裝有關。其中，HSP72與HSP73是兩種主要的HSP70。這兩種蛋白的氨基酸序列90%是相同的，它們的生化特性除了電泳動泳動度稍有差異外，其余大部分特性相同[2]。

1.2 HSP70結構[3]根據氨基酸的一級結構，可將HSP70分為三個功能域：ATP酶活性區，也稱核苷結合域（nucleotide biding domain，NBD），由近N端大小為45 kD的氨基酸序列組成，此區在結構上高度保守。立體結構上NBD由4個結構亞區組成2個相似的葉，結合并水解ATP。

多肽結合區（peptide biding domain，PBD），由 ATP 酶活性區后大小為15 kD、結構上相對保守的氨基酸序列組成，在立體結構上PBD包含1個β-夾層結構亞區和1個α-螺旋結構亞區，在2個結構亞區間形成多肽結合袋狀結構，能與底物多肽結合。

功能不明區，可能與特定的蛋白底物結合有關，包括近C端大小為10 kD的結構多變氨基酸序列。

2 應激時HSP70的生物學特性

2.1 提高細胞對應激原的耐受性[4]研究表明，HSP70可提高細胞對應激原的耐受性。其一，許多耐熱的細胞株HSP70表達水平升高，有研究發現細胞表達HSP70的生成量與細胞的耐熱性成正相關；其二，競爭性抑制細胞內HSP70基因表達或注射HSP70抗體后，細胞的熱敏感性更高；其三，在一些應激原刺激下產生的HSP70，具有保護組織細胞免受其它不同應激原的損害。

2.2 分子伴侶作用[5-8]目前認為，HSP70是主要的伴侶蛋白，其作用是與新生、未折疊、錯誤折疊或聚焦的蛋白質結合，使某些蛋白質解離，減少產生不溶性聚集物，加速正確的肽鏈折疊，促進某些變性蛋白的降解和清除。在多種應激情況下，HSP70的合成可增強應激細胞處理非折疊和/或變性蛋白的能力，因而增加了暴露于廣泛致死性刺激下細胞的存活。

2.3 抗細胞凋亡作用[9-11]研究表明，細胞內HSP70水平的升高可通過阻斷信號通路，抑制應激誘導的蛋白激酶38（PK38）和JNK激活，從而減少細胞凋亡。線粒體可能是細胞選擇死亡 （炎癥擴大）或凋亡 （炎癥受限）的關鍵細胞器，HSP70對線粒體的保護可能是HSP70的重要的抗凋亡機制。

2.4 免疫功能 HSP70還有結合細胞內糖皮質激素受體，激活蛋白激酶C及蛋白酶活性、ATP水解、生成過氧化物歧化酶（SOD）等功能，使細胞自衛，并維持其生物學特性，并參與免疫反應和抑制炎癥反應。HSP70在受損細胞表面的表達可幫助免疫系統識別清除這些毒性細胞。HSP70還可以協助抗原提呈給T細胞而參與細胞免疫，抑制IL-1、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）等炎癥介質的表達[12]。

2.5 抗氧化應激作用[13]機體應激時氧自由基生成增多，通過脂質氧化對生物膜的通透性發生巨大的影響，對細胞及細胞器造成破壞。HSP70抑制產生氧自由基的關鍵酶，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，通過反饋抑制作用減少氧自由基的產生，還可提高內源性過氧化酶水平，從而加快氧自由基的清除。同時，HSP70還可對抗H2O2對細胞膜的損傷，減少Ca2+細胞，從而保護細胞免受由活性氧族介導的Ca2+內流引起的細胞毒性和細胞凋亡。

3 應激狀態下HSP70的表達與調控

HSP70基因定位于第6、14、21對等染色體上，由2 440個核苷酸組成。其5’端3’端分別含有非編碼的212和242個核苷酸序列。5’端上游是TATA盒的熱休克元件。人類與果蠅的基因序列有72%的同源性，與E.coli有50%的同源性。證明HSP70在進化中的高度保守性[14]。人類HSP70基因與其它的HSP基因一樣，不含有內含子。這與HSP70在應激及損傷時需要迅速表達相適應。HSP70家族的表達是一個復雜的生物學過程。但各項研究表明，HSP70表達主要與熱休克轉錄因子（HSF）以及熱休克轉錄元件（HSE）相關。

3.1 熱休克轉錄因子（heat shock factor，HSF） HSF，是一類結構和功能具有廣泛同源性，普遍存在于真核細胞中的蛋白質。HSF 按其功能分為 HSF1、HSF2、HSF3、HSF4四類。 其中HSF1是HSP70表達的主要調控因子，HSF1也被稱為快速的應激反應因子[15]。在不同物種中是高度保守的；HSF2主要對熱反應進展期的信號進行應答；HSF3是鳥類特有的熱休克調控因子；HSF4僅在人體中存在，與白內障的發生密切相關。不同的HSF介導不同的生理環境刺激下的應答。正常狀態下，HSF以無活性的單體形式存在于胞漿中，在應激狀態下，HSF活化作為轉錄因子，與HSE結合，啟動HSP70基因的轉錄翻譯。

近年來研究表明，盡管不同物種間HSF存在差別，但基本上都含有四個結構域：DNA結合區域 （DNA binding domain，DBD）、三聚區域（trimerization domain，TD）、調節域（regulatory domain，RD）、 轉 錄 活 化 域 （transcriptional activation domain，TAD）。HSF1 具有 529 個氨基酸，在不同的物種中結構高度保守，含有DBD、TD、RD和TAD四個區域。DBD、TD是HSF1中結構高度保守的兩個核心區域。Bonner等通過實驗證明，DBD、TD保守序列對HSP70基因的表達調控發揮著重要作用。

位于N端的DBD區域主要通過與DNA上的大溝結合，其結合位點就是DNA上的熱休克元件（heat shock element，HSE）。HSF1能識別HSE上特異性的“-nGAAn-”結構，并結合到HSP基因上，誘導基因的轉錄。

TD結構域是由三個疏水七氨基酸重復序列 （hydrophobic heptad repeats，HR-A/B）的螺旋環結構形成。HSF1 通常通過三聚化結構域與其它蛋白或自身相互作用。正常狀態下，HSF1通過TD區域與HSP結合，以無活性的單體形式存在。當HSF1活化時，三個單聚體通過TD區域結合形成具有強大的親和力的三聚體，三聚體結合到HSPDN上，誘發轉錄的開始。

RD區被認為是人感受熱壓力的關鍵，主要通過兩個特殊絲氨酸/脯氨酸基序使S303和S307進行結構性磷酸化，在正常溫度下對HSF1轉錄活性進行負調控。

TAD區位于C端，由RD區結合，調節HSP70基因轉錄的活性[16，17]。

3.2 熱休克元件（HSE） HSE是熱休克蛋白基因5號臂上的一個特殊的DNA識別序列，位于HSP70基因啟動子TATA盒上游。是一段高度保守的DNA序列。HSE能與HSF1的DBD區域結合，募集更多的啟動因子，促進HSP70基因的轉錄[18]。HSE結構主要為nnGAAnnTTCnn，其中nGGAn五核苷酸為核心序列組合，是HSF1在DNA上的結合位點。

3.3 HSP70家族的基因轉錄 HSP70的基因表達調控是一個復雜的過程，其具體機制尚未完全清楚。目前學術界大致存在有以下幾種機制

3.3.1 應激時變性蛋白與HSF1對HSP70的競爭學說 在正常細胞中，HSP的表達很少，HSF1呈單體形式存在。單體HSF1通過TD區與HSP70結合，使得兩者都處于一種無活性的狀態。

當發生應激及其損傷時，細胞內產生大量的非穩定蛋白、變異蛋白、以及新生和轉移的蛋白前體。這些異常蛋白與HSP70的結合能力強于HSF1，競爭性的與HSP70結合。HSP70發揮生物學效應，對變異蛋白進行修復或清除。

同時游離的HSF1單體增多，通過TD區形成三聚體，具有較高的結合DNA的活性。HSF1形成三聚體后進入細胞核中，使得絲氨酸殘基磷酸化，結合到HSP基因5’端啟動子區的HSE。HSF1與HSE結合后，啟動HSP70基因的誘導表達。

HSP70基因表達，產生大量的HSP70，對應激中的受損變異蛋白及新生蛋白進行修復或清除，達到保護細胞的目的。隨著應激反應的減弱，細胞進入復愈階段，對HSP70的需求減少。此時，剩余的HSP70又重新結合到HSF1上，兩者重新形成無活性單體，HSP70基因轉錄停止。

在此過程中，HSF1對HSP70的合成起到一個負反饋的作用，既保證HSP70的足夠量的表達，同時也避免過多的HSP70的合成，對機體造成損傷。是目前較被廣泛認同的一種機制。

此外，Zou等則認為，在正常細胞中，是HSP90與HSF1結合，抑制了HSF1的活性。當應激及其損傷發生的時候，變性蛋白與HSP90結合，釋放HSF1。游離的HSF1三聚化之衙，引起 HSP70 基因的轉錄[19，20]。

3.3.2 泛素（Ub）學說 Munro等認為，HSP70的表達與泛素（Ub）非依賴性溶酶體蛋白降解系統密切相關。他們認為：在正常情況下，HSF1以無活性的單體形式呈泛素化狀態。而在應激狀態下，細胞內產生大量變性蛋白激活了Ub介導的蛋白降解系統，游離的Ub水平下降，與HSF1的結合減少，致游離態單體HSF1增多。單體HSF1形成具有活性的三聚體形式，磷酸化并進入細胞核內，與HSE結合，在RNA聚合酶作用下誘導HSP70基因的轉錄。伴隨著變性蛋白大量被水解酶降解，加之細胞不斷合成新的Ub，HSF重新與Ub結合，失去活性。終止HSP70基因的轉錄[21]。

3.3.3 熱休克因子結合蛋白學說 也有學者認為，在正常細胞中，HSF1呈無活性的單體形式存在。當應激時，變性蛋白與HSP70結合，釋放HSF1。HSF1三聚化后進入細胞核中，磷酸化并結合到DNA上，誘導HSP70基因的表達。當蛋白表達足量時，HSF1的DNA結合活性減弱，HSBP與HSP70瞬時發生相互作用生成HSBP-HSP70復合物。此時，伴隨著HSF1三聚體解體為HSF1單體而失活。誘導產生的HSP70與HSF1單體結合，抑制三聚體的產生，形成一個明顯的反饋抑制調節通路。

4 HSP70的表達及調控

HSP70基因轉錄之后，形成HSP70mRNA，翻譯形成HSP70蛋白質。研究發現，在正常情況下HSP70mRNA的半衰期只有15～30 min；而應激時，HSP70mRNA的穩定性增強，半衰期可達4 h，并通過細胞內存在的識別HSP70mRNA的5’端前導區特異異構系統，可以選擇性將其翻譯出來，即通過增強HSP70mRNA的穩定性和優先翻譯HSP70mRNA來緩解應激對機體的影響[22]。

但有報道稱，HSP70的轉錄與翻譯存在著不一致，提示HSP70基因的轉錄激活是獨立于蛋白合成過程的。有人在細胞培養實驗中發現，HSP70mRNA在應激狀況下增加，然而HSP70水平卻基本不變。

綜上所述可知，HSP70作為一種在進化上高度保守的應激蛋白，在機體應激及其損傷中發揮著重要作用。但其具體的誘導因素是什么？這些應激因素是通過什么途徑對熱休克蛋白進行誘導？以及HSP70具體的表達及調控機制如何？等這些都是在基礎研究及臨床應用中的一系列待以解決的難題。若能更好的將這些問題進行闡述，可對HSP70應激蛋白進行人工誘導，將為創傷、外科手術或移植等病理生理過程中細胞和器官的保護提供一個新的有效的途徑。

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