食管鱗癌患者外周血Th17細胞的檢測及意義

胡 琴，陳德玉

(1江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212001;2江蘇大學附屬醫院)

Th17細胞以表達IL-17而得名，是不同于Th1、Th2細胞的C D4+T細胞的新亞群，已經被證實參與機體的免疫應答、炎癥反應、自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的發生、發展［1～3］。近年來的一些研究發現，Th17細胞在炎癥相關性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用，多種腫瘤患者機體內外周血及(或)腫瘤局部存在Th17細胞比例增高。本研究檢測食管鱗癌患者外周血Th17細胞的比例變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年4月18日～2010年7月31日江蘇大學附屬醫院胸外科33例食管鱗癌患者的外周血標本，其中男20例、女13例，年齡46～73歲、平均60.3歲。腫瘤位于食管上段者7例，中段者15例，下段者11例;腫瘤直徑＞3cm者21例，≤3cm者12例;高、中分化23例，低分化及以下10例;TNM分期(2009 UICC)Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期3例。上述患者均有明確的病理診斷，且之前未接受過放、化療等抗腫瘤治療，均無傳染性疾病、自身免疫性疾病等病史及免疫治療史，且近期無感染性疾病等。18例健康志愿者外周血標本由江蘇大學附屬醫院體檢中心提供，其中男11例、女7例，年齡45～70歲、平均58.9歲，均無傳染性疾病、自身免疫性疾病等病史及免疫治療史，且近期無感染性疾病史等。本實驗分3組:健康對照組及食管鱗癌(Ⅰ+Ⅱ)和(Ⅲ+Ⅳ)組。

1.2 主要試劑與儀器 熒光抗體鼠抗人CD4-APC、IL-17-PE購自eBioscience公司;佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)購自BD公司;莫能霉素購自Enzo公司;固定與透膜試劑盒(FIX/PERM)購自CALTAG公司;淋巴細胞分離液(Ficoll)購自天津灝洋試劑廠;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購自 Gibco公司;FACS Calibur流式細胞分析儀為BD公司產品。

1.3 實驗方法 在無菌條件下以EDTA抗凝管抽取研究對象外周靜脈血6 ml。Ficoll密度梯度離心法常規分離外周血單個核細胞。以含10%FBS的1640培養液重懸細胞，調整細胞密度至1×106/ml。加入刺激劑 PMA(50 ng/ml)、Ion(1 μg/ml)及阻斷劑莫能霉素(2 μl)，予37℃、5%CO2條件下培養5 h。取細胞懸液 100 μl，加入 10 μl APC 標記的抗人CD4抗體，孵育30min后洗滌3次。加入100 μl固定劑A，反應15min后洗滌1次，再加入100 μl透膜劑B，反應5min后加入10 μl PE標記的抗人IL-17抗體，孵育30min后洗滌3次，以300 μl冷 PBS重懸細胞。24 h內采用流式細胞術檢測分析。流式細胞儀檢測以CD4設門，分析門內CD4+IL-17+細胞亞群，用 Cellquest軟件分析 CD4+IL-17+細胞占CD4+細胞的比例。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測結果 食管鱗癌患者外周血Th17細胞占CD4+T細胞的比例為(6.3±3.5)%，顯著高于健康對照組(1.8±1.2)%(P＜0.01)。食管鱗癌(Ⅰ+Ⅱ)期組外周血Th17細胞占CD4+T細胞的比例為(3.4±1.1)%，較健康對照組上調(P＜0.05);食管鱗癌(Ⅲ+Ⅳ)期組為(8.4±3.9)%，顯著高于健康對照組(P＜0.01);食管鱗癌(Ⅲ+Ⅳ)期組Th17細胞比例顯著高于(Ⅰ+Ⅱ)期組(P＜0.01)。

2.2 Th17細胞比例與臨床病理特征的關系 Th17細胞比例與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度無明顯相關，而與淋巴結轉移和TNM分期相關(P均＜0.01)。

3 討論

我國處于世界食管癌相對高發地帶，其發病和死亡平均水平列惡性腫瘤前列［4］。越來越多的證據表明，包括食管鱗癌在內的許多腫瘤的發生、發展都與炎癥聯系密切。IL-17作為Th17細胞的標志性細胞因子，具有強烈的促炎癥作用。Zhang等［5］發現，胃癌患者外周血Th17細胞比例較健康對照組增高，且Th17細胞比例增高的程度與胃癌的臨床分期有關，認為Th17細胞可能促進胃癌的病理進展。Le Gouvello等［7］發現，結腸癌患者腫瘤組織內Th17細胞的比例明顯高于自身正常結腸內的Th17水平。與結腸癌中的發現相似，Zhang等［8］研究證實，肝細胞癌患者的腫瘤組織與非腫瘤組織相比，Th17細胞水平也升高。另有Sfanos等［9］報道Th17細胞參與前列腺癌的發生、發展。

本研究結果顯示，食管鱗癌患者外周血單個核細胞中Th17細胞占CD+4T細胞的比例顯著高于健康對照組，因此，我們推測Th17細胞在食管鱗癌的發展過程中可能起著重要作用。同時，結合患者的臨床及病理資料，我們發現食管鱗癌患者外周血中Th17細胞的比例與患者的年齡、性別及腫瘤的位置、大小、浸潤深度、分化程度無明顯相關性，而與腫瘤的TNM分期及有無淋巴結轉移明顯相關。此結果提示我們，食管鱗癌患者外周血中Th17細胞的比例顯著增高是食管鱗癌的后期事件，在腫瘤發生的早期，癌腫對全身免疫系統的影響不明顯，而隨著癌腫的不斷進展，可影響到全身，使Th17細胞不斷增加，進而導致患者外周血中Th17細胞比例進一步增高。因而，我們認為Th17細胞參與了食管鱗癌的病理進展，檢測其水平對于判斷病期及預后有一定價值。

［1］Kolls JK，Linden A.Interleukin-17 family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21(4):467-476.

［2］Bettelli E，Oukka M，Kuchroo VK.TH-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity［J］.Nature Immunology，2007，4(8):345-350.

［3］Chen X，Vodanovic-Jankovic S，Johnson B，et al.Absence of regulatory T-cell control of TH1 and TH17 cells is responsible for the autoimmune-mediated pathology in chronic graft-versus-host disease［J］.Blood，2007，110(10):3804-3813.

［4］鄒小農.食管癌的流行病學［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13(18):1-4.

［5］Zhang B，Rong G，Wei H，et al.The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，374(3):533-537.

［6］Miyahara Y，Odunsi K，Chen W，et al.Generation and regulation of human CD4+IL-17-producing T cells in ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(40):15505-15510.

［7］Le Gouvello S，Bastuji-Garin S，Aloulou N，et al.High prevalence of Foxp3 and IL-17 in MMR-proficient colorectal carcinomas［J］.Gut，2008，57(6):772-779.

［8］Zhang JP，Yan J，Xu J，et al.Increased intratumoral IL-17-producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients［J］.J Hepatol，2009，50(5):980-989.

［9］Sfanos KS，Bruno TC，Maris CH，et al.Phenotypic analysis of prostate-infiltrating lymphocytes reveals TH17 and Treg skewing［J］.Clin Cancer Res，2008，14(11):3254-3261.