血清抗碳酸酐酶Ⅲ抗體ELISA檢測方法的建立與初步應用

(首都醫科大學宣武醫院，北京 100053)

碳酸酐酶(CA)是一組含鋅的金屬酶，廣泛參與機體的多種生理過程［1，2］。研究表明，抗CAⅡ和抗CAⅣ抗體參與系統性紅斑狼瘡、自身免疫性胰腺炎、硬皮病、子宮內膜異位癥等疾病的發生發展［3～6］。但國內尚無自身免疫疾病患者和健康人群的血清CAⅢ抗體水平的報道。2009年5月～2010年2月進行本研究，著眼于建立適用于臨床的抗CAⅢ抗體的ELISA檢測方法，并對健康人群和自身免疫疾病患者抗CAⅢ抗體水平進行初步調查。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 系統性紅斑狼瘡患者40例，男7例、女33例，年齡20～35歲、平均29歲;皮肌炎患者9例，男3例、女6例，年齡25～35歲、平均31歲;高血壓腎病患者30例，男女各半，年齡65～75歲、平均70歲;2型糖尿病腎病患者30例，男18例、女12例，年齡65～75歲、平均68歲;選取性別、年齡匹配無上述疾病的健康人為對照。所有受試者均知情同意。按照已建立的方法分別使用小牛血清和健康人血清為陰性對照，對上述人群血清的抗CAⅢ抗體水平進行測定，根據健康對照測定均值+2SD 確定 cutoff值［6］。

1.2 實驗材料 酶標板，Costar;洗板機，雷杜RT-3000;酶標儀，雷杜RT-6000。重組人CAⅢ(33.9 kDa，貨號:ab82823)，abcam公司;小鼠抗人 CAⅢ單克隆抗體(貨號:ab54913)，abcam公司;抗CAⅣ抗體(貨號:sc-25598)，Santa Cruz公司;HRP標記的二抗、四甲基聯苯胺，KPL公司;Tween-20、小牛血清、H2O2，上海生工;其他為國產分析純試劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 ELISA操作步驟 根據預實驗結果，使用包被緩沖液稀釋CAⅢ至5 μg/ml;包被的酶標板用保鮮膜封好，置4℃過夜;使用洗滌液緩沖液清洗5次，每孔加入封阻緩沖液，于室溫下放置30 min，用洗滌液洗板5次;每孔加入100 μl經1∶50稀釋后的血清樣品及陰性對照，室溫(20℃)放置1 h，洗滌緩沖液洗板5次;每孔加入封閉緩沖液稀釋的二抗100 μl，室溫放置 1 h;每孔中加入 100 μl底物緩沖溶液，室溫避光反應30 min;每孔加入25 μl終止液，讀取450 nm處(參考波長630 nm)OD值。

1.3.2 抗體工作濃度的確定 抗原包被濃度為5 μg/ml，標準樣品按照 1∶1 000～1∶32 000 倍比稀釋，在每個標準樣品倍比稀釋孔中分別使用不同稀釋倍數(1∶500～1∶8 000)的酶標二抗，其他實驗條件一致，比較各孔450 nm處(參考波長630 nm)OD值，確定酶標二抗的稀釋倍數，最后建立標準方程。

1.3.3 方法學考證 精密度:取高(OD=3.0)、中(OD=1.2)、低(OD=0.5)3 個濃度的標準品，每份樣品同批測定20次，計算批內精密度;每份樣品每天測定1次，連續測20 d，計算批間精密度。穩定性［7］:①試劑穩定性:新鮮配制的試劑置4℃冰箱，分別于第2、4、8、15和30天測定同一中值標準品，計算變異系數;②標本穩定性:3份OD中值患者血清分裝為2組，第1組保存于室溫(約20℃)，并于第2、6、12小時進行測定，第2組保存于4℃，于第6、12、24 小時進行測定。靈敏度［8］:使用公式OD靈敏度=OD零劑量+t0.95×SD/n 計算 95%可信區間下的靈敏度(n=20)。回收實驗:測定中值抗CAⅢ抗體標準品，后于該標準品中加入高濃度抗CAⅢ抗體溶液，使其終濃度計算值為中值標準品的110%，根據前后測定結果計算回收率。干擾實驗:標本性狀的干擾:分別使用正常、乳糜、黃疸及溶血的血清標本(排除自身免疫性疾病)稀釋抗CAⅢ抗體標準品，使用已建立的方法分別對其進行檢測;CA同工酶的干擾:分別對抗CAⅣ抗體(1∶100稀釋)及抗CAⅣ抗體中值標準品與抗CAⅢ抗體(最終稀釋倍數為1∶100)的混合物進行檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0軟件進行One-Way ANOVA分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA標準曲線方程的建立 方陣滴定實驗結果顯示，OD值在酶標二抗稀釋倍率為1∶2 000～1∶4 000時開始出現明顯變化，考慮其OD值應大小適中，選擇酶標二抗的稀釋倍數為1∶2 000。在上述反應條件下，以抗CAⅢ抗體標準溶液稀釋倍數(T)的自然對數(logeT)為橫軸，以OD值A為縱軸，使用SPSS11.0軟件繪制標準曲線，結果顯示logeT與其OD值之間存在良好的線性關系，R2=0.95，標準方程為:Y= －0.13logeT+1.59。

2.2 方法學評價 3個水平標準品的批內精密度為 5.6%～6.7%、平均 6.2%，批間精密度為 7.5%～8.8%、平均 8.2%。靈敏度為 0.025。試劑穩定性和標本穩定性試驗中，各個時間點測定結果之間的變異程度均低于10%。經測定并計算，回收率為106%。血紅蛋白濃度為12 g/L的溶血標本、甘油三酯為23.5 mmol/L的乳糜標本、膽紅素為571 μmol/L的黃疸標本及抗CAⅣ抗體均不能對本實驗造成顯著影響。

2.3 臨床樣本檢測應用 分別使用小牛血清和健康人血清作陰性對照，前者的測定結果略低但不存在顯著性差異，為減少基質效應的影響，對患者標本進行測定時均使用健康人血清為陰性對照。糖尿病腎病組的血清抗CAⅢ抗體水平(0.33±0.06)高于健康對照組(0.03 ±0.02)(P ＜0.05);高血壓腎病組的血清抗CAⅢ抗體水平(0.04±0.02)略高于健康對照組(0.03±0.02)，但無顯著性差異(P＞0.05)。系統性紅斑狼瘡組的血清抗CAⅢ抗體水平(1.12 ±0.19)高于健康對照組(0.04 ±0.01)(P＜0.05)。抗CAⅢ抗體陽性率在系統性紅斑狼瘡患者為43%，糖尿病腎病患者為18%，皮肌炎、高血壓腎病患者和健康對照未出現陽性結果。

3 討論

自身抗體的檢測在很多疾病尤其是自身免疫性疾病的診治中的重要性日益凸顯，CAⅢ抗體作為自身抗體的一種已經引起了很多科研工作者的重視［2］。但對其進行的研究大多還基于免疫印記、原位雜交等［3，9］，這些方法雖然靈敏可靠但操作復雜，成本偏高，不能廣泛應用。目前國內并沒有對CAⅢ抗體檢測的試劑盒，本研究成功建立了人血清CAⅢ抗體的ELISA檢測方法，其精密度、穩定性、抗干擾能力等技術指標均能滿足ELISA常規檢測的要求，且操作方法簡單，檢測結果穩定，所用試劑市場均有銷售，檢測成本與常規ELISA檢測類似，可上機進行大批量分析，具備進入臨床應用的潛質。

已有研究表明，抗CAⅢ抗體可出現于風濕性關節炎患者［9］，抗CAⅠ、CAⅡ和CAⅣ抗體可出現于自身免疫性胰腺炎患者［6］;人體內CAⅡ抗體與CAⅡ的結合可使CA發生空間構象改變并影響酶的活性位點，導致酶活性降低30%以上［5］，而抑制CA的功能可導致細胞內環境紊亂和功能障礙，甚至引起細胞內酸中毒［10］。人體內如果累積過多的抗CAⅢ抗體必然會與CAⅢ發生免疫反應，干擾CA的正常功能，進而可能對疾病的發生發展產生不利影響。

本研究結果提示，抗CAⅢ抗體可出現于系統性紅斑狼瘡患者和2型糖尿病腎病患者。由于細胞和體液免疫功能障礙，系統性紅斑狼瘡患者體內產生多種自身抗體，約50%患者有腎臟疾病臨床表現，大部分患者在某一階段發生一項或幾項血液系統異常，CAⅢ在腎臟和紅細胞中的含量較豐富，其自身抗體很有可能參與了本病的發生發展［11］。皮肌炎的主要特點是肌肉和皮膚受累，較少累及CAⅢ含量較豐富的血液系統和腎臟，這可能是皮肌炎患者血清抗CAⅢ抗體與健康對照無顯著性差異的原因。2型糖尿病腎病是2型糖尿病的重要慢性并發癥之一，自身免疫在2型糖尿病腎病的發生發展中占據重要作用，細胞外基質在腎小球、腎小管聚集導致的腎小球硬化及腎間質纖維化是其特征性病理改變。研究表明［5］，當免疫復合物在腎單位沉積時，能刺激浸潤的淋巴細胞及腎小球細胞釋放炎癥介質，包括補體、生長因子、血管活性物質、細胞活素類物質等，從而促進2型糖尿病腎病的進展。本研究發現2型糖尿病腎病患者血清中抗CAⅢ抗體濃度與健康對照組相比有顯著差異，且與國外使用免疫印記方法進行的測定具有相同的變化趨勢［12］，提示抗CAⅢ抗體可能參與了本病的發生發展。高血壓腎病患者血清的抗CAⅢ抗體水平與對照組無顯著性差異，這一結果從側面印證了糖尿病腎病具備自身免疫性疾病的特點，因此使用本法對同時患有糖尿病和高血壓的患者進行監測可能對確定其腎臟損傷的病因提供幫助。在健康對照組實驗中，年齡較高受試者的抗CAⅢ抗體水平略高于低齡受試者，但不存在顯著性差異，這種現象可能是增齡性的自身抗體水平升高所致。

目前國內外已有越來越多的學者關注CA自身抗體的研究，并在多種疾病中發現其自身抗體，但這些研究大都處于臨床觀察階段，各型CA同工酶自身抗體的疾病特異性、對相關疾病發生發展的影響及其機制仍需進一步研究。

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