分子生物學技術在動物營養學中的研究現狀與展望

王濤 （山東省膠南市張家樓鎮青島康大兔業發展有限公司繁育中心 266406)

?

分子生物學技術在動物營養學中的研究現狀與展望

王濤 （山東省膠南市張家樓鎮青島康大兔業發展有限公司繁育中心 266406)

隨著動物營養學的不斷發展，動物營養學在現有的條件下在生產性能等方面的提升空間已近很小，所以急需一種新的技術來改變這一現狀，來實現動物營養學的再次飛越。分子生物學的產生是動物營養學突破這一現狀成為了可能。基因克隆、轉基因技術、基因工程的出現將分子生物學技術在生物學的研究推向分子水平，分子生物學技術已成為研究和揭示生命現象本質和規律的一種重要工具。動物機體的生理病理變化，如生長發育、新陳代謝、遺傳變異、免疫與疾病等，從本質來說，都是基因的表達、調控發生改變的結果。許多生命現象最終需要在分子水平上解釋闡明。所以，動物營養學的研究應用與分子生物學技術，尤其是與基因工程技術相結合，使人們研究營養素對機體的作用機制、動物機體的生理病理變化等問題從機體水平上轉移到分子水平上來，這是動物營養學今后的發展趨勢之一。因此，及時全面地了解分子生物學理論和技術的發展對指導動物營養學的研究有特別重要的意義[1,3]。

1　營養與基因表達調控的關系

所謂基因表達是指按基因組中特定的結構基因上所攜帶的遺傳信息，經轉錄、翻譯等步驟指導合成具有特定氨基酸順序的蛋白質過程。隨著分子生物學技術的不斷發展，越來越多與代謝有關的動物基因被克隆和鑒定，人們對營養與基因調控的關系越來越感興趣。營養與動物基因表達調控的研究已成為當今動物營養學研究的一個熱點領域。AUSTIN等描述了營養與基因表達的關系是營養素攝入影響DNA復制和改變染色體結構，二者又共同調控基因表達，即調控基因轉錄、翻譯，決定基因產物，從而維持細胞分化、適應與生長。研究表明,主要的營養物質如糖、脂肪酸、氨基酸以及一些微量元素對動物體內許多基因的表達都有影響[3]。

1.1 日糧碳水化合物對磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表達的調控 運用現代分子生物學的手段和方法已能夠確定日糧中的某些營養物質與基因的表達之間存在著密切的聯系。目前研究較清楚的是日糧中糖含量對磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表達的調控。PEPCK是動物肝和腎中糖異生作用的關鍵酶。當動物進食含有大量糖類的飼料時，PEPCK的啟動子就會關閉，肝中 PEPCK水平大幅度下降；反之，PEPCK的啟動子就會處于打開狀態，肝中PEPCK水平得到大幅度提高。可見，營養成分對PEPCK的調控主要通過與啟動子作用而實現的[4]。研究發現，這種酶的啟動子在基因轉錄的啟動部位(500bp范圍內)包含有多種調節因子的結合位點，它們在代謝信號對基因作用時有重要意義。PEPCK基因轉錄的調節取決于胰島素和cAMP的相對水平，而這又與糖的攝取有關[4]。所以，當進食含大量糖類的飼料時，由于cAMP水平的急劇下降以及胰島素水平的急劇上升，從而抑制PEPCK基因的表達，導致肝中PEPCK水平大幅度下降；而當禁食或飼喂高蛋白低糖的飼料時，則情況相反。

1.2營養對脂肪酸合成酶(FAS)基因表達的調控 FAS是脂肪酸合成的主要限制酶，存在于脂肪、肝臟等組織中，在動物體內起催化丙二酰CoA連續縮合成長鏈脂肪酸的反應，其活性高低直接控制著體內脂肪合成的強弱,從而影響整個機體中脂肪的含量[6]。有關營養與FAS基因的表達調控，HESKETS等報道，糖類能誘導FAS基因的轉錄，而脂肪則抑制這種誘導的表達。研究表明，當給禁食后的成年鼠飼喂高糖低脂肪的飼料時，FAS基因的表達增強，而且相應的mRNA含量的增加幅度與碳水化合物的攝入量成正比[6]。（1）糖類對FAS基因表達的影響：研究表明,葡萄糖對FAS基因的表達調控可以通過與胰島素的協同作用而得到顯著提高。加入葡萄糖和胰島素的脂肪細胞培養組織中，FAS mRNA水平比對照組提高了28%，單獨添加葡萄糖比對照組提高了7%，而單獨添加胰島素則沒有效果。RHOADS等發現，3-O-甲基葡萄糖不能激發FAS基因的表達，而6-磷酸-2-脫氧葡萄糖在脂肪組織中有類似葡萄糖的作用，能激發FAS基因的表達，這說明葡萄糖必須通過中間代謝環節才能對FAS基因的表達調控起作用[7]。試驗表明，在成年大鼠肝細胞培養物中6-磷酸-2-脫氧葡萄糖水平與FASmRNA含量呈正相關。因此，6-磷酸-2-脫氧葡萄糖極有可能是參與FAS基因表達的重要中間代謝物[5]。（2）日糧脂肪酸對FAS基因表達的影響：大量研究表明，日糧脂肪酸對FAS基因表達具有抑制作用，特別是日糧多不飽和脂肪酸(PUFA)(n-3)系可以抑制肝臟中脂肪合成，降低脂肪酸以甘油三酯形式的沉積。Clarke等(1990)用飽和脂肪酸（軟脂酸）、單不飽和脂肪酸（三油酸甘油酯，n-9）、雙不飽和脂肪酸(紅花油,n-6)和PUFA(魚油n-3)喂大鼠。結果表明，日糧中PUFA降低了肝臟中FASmRNA75%~90%，飼喂紅花油大鼠肝臟中的FASm RNA豐度是魚油的2倍，說明n-3脂肪酸對FAS基因轉錄的抑制比n-6脂肪酸有效。而軟脂酸甘油酯和三油酸甘油酯對FASmRNA無影響[8,13,14,20]。（3）蛋白質對FAS基因表達的影響：BONNET的研究結果表明,高蛋白飼糧抑制豬脂肪組織中FAS基因的表達,脂肪組織中FASmRNA的含量顯著下降:用蛋白質含量分別為14%,18%,24%的日糧飼喂60~ 110kg的肥育豬,其脂肪組織中FAS mRNA的含量分別下降了8.14%，11.73%和48.20。由此可見，日糧蛋白質可以影響脂肪組織中FAS基因的表達，但具體的調控機理目前還不清楚。

1.3營養對瘦素(Leptin)基因表達的影響 Leptin是脂肪細胞分泌的一種調節體脂沉積的重要因子，是由146個氨基酸殘基組成的非糖基化多肽。Leptin是由肥胖基因(ob基因)編碼的，其表達具有組織特異性，表達部位主要在脂肪組織。動物試驗和臨床研究表明：重組人瘦素可用于肥胖癥和Ⅱ型糖尿病的治療；在動物遺傳育種方面，利用瘦素有望提高家畜瘦肉率及繁殖性能。研究表明，禁食和長鏈脂肪酸可顯著降低Leptin基因表達，重新進食后，又可恢復正常的表達；高脂肪食物可增加其表達和血漿leptin水平，腫瘤壞死因子α(TNF-α)可直接作用于脂肪細胞調節leptin的釋放，胰島素和皮質酮可增加嚙齒類和人類脂肪細胞中Leptin水平，鉻可顯著降低瘦素水平，抑制Leptin基因的表達[10,18]。

1.4 其它營養素對基因表達的調控 有研究表明，日糧中Zn缺乏降低了Leptin基因的表達；日糧中Cu缺乏導致肝臟FAS基因轉錄速度加快；日糧添加Cr可以調節葡萄糖乳酸循環和生長激素有關基因的表達，達到增加奶產和提高胴體品質的目的；Fe通過控制mRNA的穩定性和翻譯過程，調節轉鐵蛋白的水平。某些氨基酸、維生素等均可調控有關基因的表達。Met對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白as1基因的表達有影響[22]。維生素也會對基因的表達產生影響，如生物素對氨基酸轉氨甲酰酶基因的表達有重要作用。脂溶性維生素主要是對在mRNA轉錄水平上進行調控[12]。

2　分子生物學技術在動物營養學中的應用

2.1 基因重組技術 基因重組技術是將基因重新組合，使其在受體細胞中復制和表達，是改良生物性狀的有力手段。瘦肉率是動物營養學家和動物遺傳學家最為關注的問題之一，也是肌肉品質最為重要的指標之一。肌生成抑制素是骨骼肌生長的負調控因子，主要在骨骼肌中表達。其活性的喪失會引起動物肌肉的過度發育。肌纖維直徑變大或纖維數增加，表現為雙肌性狀。利用基因工程技術可以篩選肌生成抑制素的抗體或抑制劑，使其與肌生成抑制素結合，滅活其功能；或者篩選能與肌生成抑制素受體結合的物質，拮抗肌生成抑制素的功能；還可以用突變的基因與正常動物的基因進行同源重組，獲得肌生成抑制素基因缺失動物，從而提高動物的瘦肉率[9]。

植酸酶作為一種單胃動物的飼料添加劑，其飼喂效果已在世界范圍內得到廣泛的確認，它能有效的將植酸結合的磷有效的釋放從而提高機體對磷的利用率，減少磷在動物糞便中的排出量，降低了環境的污染。隨著飼料工業的發展和分子生物學的興起，植酸酶的分子生物學研究，已成為世界性的研究熱點之一。目前的研究主要集中在2個方面：一是植酸酶難以大量生產及生產成本過高。通過基因工程技術，利用生物反應器可有望成百上千倍地提高其表達量，而且反芻動物本身瘤胃微生物能合成植酸酶，利用此技術可以尋找出合成植酸酶的方法，從而得到大量的植酸酶；二是天然植酸酶的一些酶學性質(耐溫性、pH適性、催化活性等)與飼料加工業和養殖業的要求不一致。目前，已從嗜溫微生物中發現多種高溫植酸酶，利用基因工程技術在分子水平上對植酸酶基因進行改造，可以生產出既耐高溫又具有高酶活性的植酸酶品種，從而提高其在飼料中使用的有效性[1,2,11,12]。

2.2 轉基因技術 轉基因技術就是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，它是生命科學中發展最快的分支之一。隨著植酸酶的研究成為熱點，轉植酸酶基因豬的研究也成為人們關注的焦點，此研究直接達到了在不降低環境質量的前提下，對養殖業解決磷污染提供了新的技術[21]。

轉植酸酶基因豬就是將小腸中非致病區的大腸桿菌植酸酶基因與老鼠腮腺、舌下腺、頜下腺中負責合成唾液蛋白質的一小部分基因連接起來，將這個基因轉入受精的胚胎中，然后將胚胎移植到待孕母豬體內，產生具有攜帶植酸酶基因的仔豬。利用DNA分析技術檢測后代中是否具有轉入的植酸酶基因。由于引物具有高度的特異性，所以植酸酶主要在唾液腺中分泌。研究表明，用含有53%植酸磷的大豆作為唯一的磷源配制日糧，飼喂具有中等唾液植酸酶含量的轉基因豬進行檢測，結果轉基因斷奶仔豬、生長育肥豬磷的真消化率為87.9%、98.8%，而非轉基因的仔豬、生長育肥豬的磷真消化率為45.8%、51.9%。差異極為顯著(P<0.01)，且糞中磷的含量下降75%、56%[21]。

2.3 改變動物體內的代謝途徑 應用生物學技術改變動物的代謝途徑是指在動物體內導入新的代謝途徑，采用外來基因，加工后用于動物的表達。如半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸，由于半胱氨酸在羊瘤胃內降解，飼料中添加半胱氨酸并不能提高其在血清中的水平。如果羊自身能合成半胱氨酸，將會提高羊毛產量。Ward等(1991)將大腸桿菌中編碼絲氨酸轉乙酰酶、乙酰絲氨酸硫氫化酶基因和MT啟動子連接，并在3’端裝上GH基因的序列，然后通過轉基因技術將這一構件導入羊體內，得到的轉基因羊胃上皮細胞能利用胃中的硫化氫合成半胱氨酸。應用生物技術調控代謝還可通過對動物腸道微生物進行改造，賦予細菌以新的代謝能力。目前，國外已在進行將白蟻中編碼分解木質素的有關酶基因克隆并轉移給瘤胃微生物的工作，將大幅度提高反芻動物對秸桿類飼料的利用效率[14,15]。

2.4基因芯片 DNA芯片或cDNA芯片，又稱為基因芯片或微陣列，是一種基因探針。由于DNA芯片技術具有快速準確、多樣性、微型化和自動化等傳統營養學研究方法無法比擬的優點，其在營養學研究中潛在的應用前景十分廣闊。（1）尋找營養相關新基因，獲取新基因是DNA芯片技術最主要的應用之一。利用DNA芯片技術，從芯片制備、雜交到信號掃描分析整個過程，一般只需要一周左右的時間。而且DNA芯片技術可以進行生物信息處理，確定基因表達譜，被檢測目標DNA密度高，便于大量篩選新基因，大大提高了發現新基因的效率。（2）營養相關基因功能研究。DNA芯片可迅速將腫瘤、糖尿病等眾多疾病基因與營養素聯系起來，縮短實驗周期，大大加快這些基因功能的確定，從而為揭示這些疾病的分子機制提供可能[16]。(3)營養相關疾病診斷。DNA芯片可以快速地檢測基因突變，從正常基因組中分離出DNA并與DNA芯片進行雜交，即可獲得標準圖譜，從病變組中分離出DNA并與DNA芯片進行雜交，即可獲得病變圖譜，通過對這2種圖譜的比較、分析，就可以得到病變的DNA信息[17]。因此，利用DNA芯片技術監測動物中營養相關基因的差異表達，將會成為預防和治療營養相關疾病的重要手段。

3 展望

綜上所述，以基因工程為核心的分子生物學技術應用于動物營養學研究領域，具有很大的潛力，它不僅為動物營養學研究提供了一套全新的技術和方法，而且可以在基因水平上解決許多營養學問題，還可在基因水平上解決許多動物機體生理病理變化、營養素的代謝調節機制及其與機體的相互關系等問題。隨著分子生物學的發展和不斷完善，抗生素替代品的生產，動物新品種出現，生理活性物質的大量生產都將成為現實。無可置疑，以基因工程為主導的分子生物學技術將為畜牧業的發展開辟廣闊的前景，具有重要的技術意義和經濟意義。

[1] 董淑麗, 文風云, 龐有志等. 分子生物學與動物營養研究[J]. 飼料工程師, 2004, 7(131): 16-18.

[2] 史瑩華, 王成章, 許梓榮. 分子生物學技術在動物營養學中的應用與展望[J]. 河南農業大學學報, 2005, 39: 489-492.

[3] AUSTINL G, EDWARDS A P.Metabolic regulation of gene transcription[J].J Nutrition, 1994, 124:1533-1539

[4] WELLER P A, DAUNCEYM J, BATES P C.Regulation of porcine insulin-like growth factor and growth hormone receptor mRNA expression by energy status[J].Am J Physiol, 1994, 266:776-785.

[5] SVANBERG E, OHLSSON C.RhIGF-1/IGFBP complex, but not free rhIGF-1, supports muscle protein biosynthesis in rat during semistarvation[J].J Clin Invest, 2000, 30:438-441

[6] HESKETS J E, VASCONCELOSMH, BERMANO G·Regulatory signals in messenger RNA: determinants of nutrient-gene interaction and metabolic compartmentation [J]. J British Nutrition, 1998, 80:307-321.

[7] RHOADS R P·Nutritional regulation of the genes encodingthe acid-labile subunit and other components of the circulating insulin-like growth factor system in the sheep[J].J Anim Sci, 2000, 78:2681-2687.

[8] CHAPMAN C.Maternal and early dietary fatty acid intake: changes in lipid metabolism and liver enzymes in adult rats[J].J Nutrition, 2000, 130:146-150.

[9] KIRK S, OLDHAM J, KAMBADUR R, et al.Myostatin regulation during skeletal muscle regeneration[J].J Cell Physiol, 2000,184:356-367.

[10] FALLAT J, KARUNARATNE D N, HANCOCK E W.Mode of action of the antimicrobial peptide indolicidin[J].J Biol Chem,1996, 271:19298-19303.

[11] ANDREA G, OSCAR C, FRANCOSCO I, et al.Antimicrobial activity of polycationic peptides[J].Peptides, 1999, 20:1263-1273.

[12] 楊鳳, 維生素A的作用[M]. 動物營養學, 2000: 126-127.

[13] 鄔小兵, 樂國偉, 施用暉等. 營養物質調控動物基因表達作用機制[J]. 生理科學進展, 2002, 33(1): 51-53.

[14] 帥麗芳, 段銘, 高宏偉. 多不飽和脂肪酸調控基因表達的分子機制的研究進展[J]. 畜牧與獸醫, 2002, 34(12): 36-38.

[15] 趙雅林, 于紅擂. 飼料生物技術研究進展及發展趨勢[J]. 中國生物工程雜志, 2003, 23(5): 74-77.

[16] DERILSI J, PENLAND L, BROWN P O, et al·Use of a cDNA microarray to analysis gene expression patterns in human cancer[J].Nature Genetics,1996, 14:457-460.

[17] GERHOLD D, RUSHMORET, CASKEY CT·DNA chip: promosing toys have become powerful tools[J].Techniques, 1999, 24:168-173.

[18] 陳偉亮, 王志約. 營養對基因表達的調控作用[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2002(7): 47-48.

[19] 伍喜林, 郭春華, 楊鳳. 日糧營養對初物代謝調控的分子生物學基礎[J]. 湖北農學院學報, 2002, 22(1): 82-84.

[20] 趙林山, 鄭海洪, 張淑芹等. 脂肪酸與基因表達[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2001,(9): 33-34.

[21] 張永剛, 用分子生物學方法提高豬對磷的利用率[J]. 山東農業大學學報, 2007, 38(1): 147-150.

[22] 楊金勇, Met 、Met二肽對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白基因表達的影響[J]. 農業生物技術學報, 2007, 15(1): 24-27.

（2011–03–026）

S818.9

A

1007-1733(2011)03-0055-04