Wnt抑制因子SFRP基因甲基化與白血病的關系

裴 磊，葉麗平

(1中國醫科大學，沈陽110001;2遼寧醫學院病理生理學教研室)

近年來研究發現，Wnt信號通路在胚胎發育、細胞行為、基因表達、腫瘤增生以及細胞凋亡等生命過程中發揮重要作用;其異常激活會促進細胞過度生長、增殖和分化，與白血病及其相關疾病的發生和發展有著密切關系。Wnt通路抑制因子分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)在結構上與卷曲蛋白(Fz)受體極為相似，與Fz受體競爭結合Wnt從而抑制Wnt通路的活動。但當SFRP異常甲基化導致表達沉默時，對Wnt通路的抑制作用減弱，從而促進了白血病的發生與發展。本文就SFRP分子對白血病發生與發展的影響進行綜述。

1 Wnt基因家族及其信號轉導通路與白血病

至今已有大量實驗證實，Wnt通路的異常活化與許多腫瘤發生有著密切關系。Wnt信號轉導通路因其啟動Wnt蛋白而得名，包括3條細胞內信號通路:① Wnt經典信號轉導途徑，即Wnt-β-catenin信號轉導途徑;②Wnt-平面細胞極性(PCP)途徑;③Wnt-Ca2+途徑［1］。其中 Wnt-β-catenin 信號轉導途徑是Wnt中最重要也是研究最清楚的信號通路。

Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸殘基的分泌型糖蛋白，由Wnt基因編碼，通過自分泌或旁分泌發揮作用。Wnt蛋白有350～380個氨基酸組成，其中超過100個氨基酸是保守的，包括23～24個半胱氨酸殘基。Wnt蛋白分泌后與細胞表面基質及其特異性受體Fz受體相互作用。Fz受體包括一個細胞外N端半胱氨酸富集區(CRD)，7次跨膜區和胞質區(CD)。Wnt與Fz受體結合后，信號經由蓬亂蛋白(Dsh)轉導，使由 APC、axin、糖原合成酶激酶(GSK3β)、CK1α 組成的“降解復合物”聚解［2］，抑制 GSK3β 活性，防止 β-catenin磷酸化，使β-catenin降解受抑，從而使胞內游離β-catenin增多。β-catenin可以轉位核內，與淋巴細胞增強因子/T細胞因子(LEF/TCF)族中的轉錄活化因子結合，形成復合體，解除LEF/TCF的抑制狀態，增強下游靶基因的轉錄活性，從而促進細胞增殖，抑制凋亡［3］。PCP途徑［4］在脊椎動物中又稱Wnt/JUN激酶途徑，涉及到小三磷酸鳥苷酸酶Rac和RhoA，以及它們下游的 Rho激酶和 JUN激酶，主要作用可能是調節細胞的遷移，在胚胎發育過程中調控細胞的匯聚延長運動，參與原腸胚的形成［5］。Wnt/Ca2+途徑中，Wnt蛋白與Fz受體結合，通過三聚體G蛋白介導，使胞內Ca2+濃度升高，激活鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蛋白激酶C(PKC)，調節細胞生命活動［6］。

在Wnt-/β-catenin途徑中，Wnt信號通過一系列酶促瀑布反應，抑制β-catenin的降解，調控很多基因的轉錄與表達。一旦Wnt信號通路任一環節出現異常，都會使β-catenin降解受抑，導致在胞內積累過多進入核內，與核內的轉錄因子結合，刺激靶基因 c-myc、cyclinD1、MMP-7、ITF-2、fra-1、BMP-4、survivin 等的轉錄與表達［7，8］，導致細胞異常增殖、分化，最終導致白血病等腫瘤的發生。β-catenin核內水平增高是經典Wnt信號通路誘發腫瘤的關鍵環節。

2 SFRP家族成員及其與Wnt信號轉導通路

SFRP家族是Wnt抑制因子中最大的家族，其中最早發現的是Frzb，它和Fz有相似的序列，并被發現在爪蟾蜍體內能夠結合Wnt8，參與調節Wnt-β-catenin信號轉導途徑，成為SFRP作為Wnt拮抗因子的有力證據。SFRP也是一種分泌性糖蛋白，分子量30～40 kD，包括一個N端與Fz的CRD同源的半胱氨酸富含區(cysteine-rich domain)和一個C端Netrin-Related motif(NTR)。SFRP在結構上與Fz極為相似，與Fz的胞外CRD區域有30% ～50%的同源性，但是缺少7次跨膜結構域，可以與Fz競爭結合Wnt從而抑制Wnt通路的活動。研究者們雖然在開始時的研究中發現CRD對于SFRP與Wnt結合起到至關重要的作用，但是隨后的研究表明CRD可以與 Fz和Tolloid-like金屬蛋白酶相互作用，而NTR與CRD同時存在時也可以緊緊地與Wnt配體結合［9］。因此可見，SFRP基因的正常表達對于抑制Wnt信號通路異常激活有著顯著作用，從而控制核內β-catenin水平，防止腫瘤誘發。而Bovolenta等［1］則認為，SFRP除了能與Wnt或Fz受體結合形成復合體，從而阻斷Wnt信號的轉導外，還可以自身相互作用，形成二聚體，促進信號傳導;某些SFRP還可以通過轉運Wnt至Fz受體或直接與Fz結合，促進信號轉導。

3 SFRPs甲基化與白血病

近幾年對 SFRPs的研究發現，SFRP1、2、4、5啟動子中均含有CpG島結構［10］，且CpG島的頻繁甲基化的表達下調作用可以激活Wnt信號通路從而促成腫瘤細胞抵抗凋亡［11］。一旦SFRP基因高甲基化致轉錄沉默，SFRP合成減少，導致Wnt信號通路異常活化，從而使具有調控轉錄活性的核心效應蛋白β-catenin在細胞內增多并移位核內，刺激靶基因轉錄和表達，最終誘發相關腫瘤。如果發生在白細胞中，則白細胞可能會惡性、無限制地增生，浸潤全身各組織和臟器，最終或許會誘發白血病的發生。

已有研究表明，Wnt異常信號激活腫瘤的重要機制是一種或多種可溶性Wnt抑制基因的甲基化，進而轉錄沉默所致，且去甲基化后恢復其表達可抑制腫瘤的惡性行為，并由此支持SFRP基因將成為相關腫瘤的候選抑癌基因［12］。由于一定程度的SFRP表達可以抑制Wnt信號通路的傳導，當SFRP表達缺失或基因沉默時都將可能使白細胞過度增殖，促進白血病的進展。近年來已有大量研究表明，SFRP基因甲基化普遍存在于各種惡性血液病中。SFRP的CpG島甲基化所導致的基因表達沉默可引發慢性淋巴細胞白血病Wnt信號通路異常活化［13］。急性白血病中SFRP的高度甲基化也是很常見的現象［14，15］。

3.1 SFRP1 Pehlivan 等［16］為了研究在慢性髓性白血病(CML)中SFRP的表觀遺傳沉默是否與Wnt活化有關，檢測了48例處在慢性期CML患者的SFRP1啟動子的甲基化和突變水平。結果顯示有6例患者呈現半甲基化，只有1例患者完全甲基化。盡管在慢性期CML中SFRP1的啟動子甲基化很少發生，但是FRP1基因啟動子甲基化可能表明了疾病抵抗治療的一種不穩定的形式，以及一種可能的CML患者中激活經典Wnt信號通路的機制。Liu等［13］通過細致研究發現，在所有的慢性淋巴細胞白血病患者樣本中，SFRP家族成員之一的SFRP1都呈現高度甲基化狀態和下調。這表明這種表觀遺傳學的事件是白血病的發生以及發展中具有關鍵性的一步。

3.2 SFRP2 Jost等［17］通過分析急性髓性白血病(AML)中SFRP的表觀遺傳調節紊亂，利用WSP檢測白血病細胞系中SFRP1、2、4、5基因啟動子甲基化水平，發現這四種SFRP基因都出現CpG島上的異常甲基化。實時反轉錄-PCR方法檢測，證明了SFRP1、2轉錄沉默，并且對細胞系中5-aza-2＇-deoxycytidine的治療會導致再表達，異常甲基化頻率是SFRP1 29%、SFRP2 19%、SFRP4 0%、SFRP5 9%。早期AML患者SFRP2出現基因的轉錄下調并且與啟動子高甲基化之間存在聯系。Griffiths等［15］發現，SFRP2基因甲基化與AML病死率密切相關。

3.3 SFRP4 Liu 等［3］發現 SFRP4 作為 Wnt信號通路的負性調節因子，其在CML中基因的甲基化頻率較高。但是在AML中SFRP4基因啟動子甲基化比例不高(10.2%)。Xu等［14］在檢測四種白血病細胞系SFRP甲基化程度時發現，SFRP4在NB4、Molt-4和Jurket中發生甲基化，但是在HL60中甲基化與非甲基化同時被檢測到，呈部分甲基化狀態。

3.4 SFRP5 Jost等［17］在研究惡性漿細胞紊亂 Wnt途徑表觀遺傳調節失常的臨床影響時，發現SFRP5的甲基化只局限于成熟期的多發性骨髓瘤以及漿細胞白血病，提示SFRP5基因高度甲基化可能對多發性骨髓瘤的發生與發展起到一定作用。Griffiths等［15］研究發現，SFRP2和SFRP5基因的甲基化程度與AML復發的風險相關聯。

徐成波等［11］通過研究發現，在9種惡性血液病細胞系中SFRP1、2基因啟動子區均呈高甲基化狀態，CA46、HL60和U937細胞中的SFRP4基因以及U266細胞中的SFRP5基因啟動子區呈部分甲基化狀態，其他細胞系SFRP4、5基因啟動子均呈完全甲基化狀態。正常人外周血單個核細胞中SFRP1、2、4、5基因啟動子區均呈非甲基化狀態。在59例AML患者中，SFRP1、3、4、5基因異常甲基化頻率分別是33.9%、23.7%、6.8%、10.2%;在 28 例急性淋巴細胞白血病患者中，SFRP1、2、4、5 基因異常甲基化頻率分別為39.3%、28.6%、25.0%、32.1%。這說明 SFRP 基因啟動子區的異常甲基化與惡性血液病的發生密切相關，并且SFRP家族中成員(SFRP1、2、4、5)在各種類型的白血病中甲基化的程度不一，不同的SFRP分子在各種類型白血病的發生、發展、轉化的過程中的表達以及對各種白血病的影響不盡相同。

4 結語與展望

SFRP家族是Wnt途徑的調節因子。SFRP通過抑制Wnt信號通路，在細胞凋亡、胚胎發育、抗腫瘤等方面發揮關鍵作用，并能抑制細胞增殖與分化。其表達缺失、基因沉默或過度表達都可能促進腫瘤發生，因此與多種惡性腫瘤的產生密切相關。SFRP基因可能是一個與白血病相關的抑制基因，抑制Wnt信號通路轉導，在白血病的發生和發展過程中起到重要作用，可能成為白血病診斷的一種生物學標記［18］，并且為白血病靶向治療的開展提供新的思路及廣闊的應用前景。SFRP對Wnt的調控活動機制非常復雜，尚需進一步的研究。

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