腎透明細胞癌腫瘤相關基因的表達

肖耀軍,陳壯飛,鄭少斌

(南方醫科大學附屬南方醫院,廣州 510515)

腎透明細胞癌(ccRCC)是泌尿外科較常見的一種惡性腫瘤。我們采用 60～70mer的長鏈寡核苷酸基因芯片,檢測ccRCC組織和癌旁正常腎組織的基因表達譜,分析其基因差異表達情況,探討腎透明細胞癌的腫瘤相關基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年2月～2007年3月本院收治的ccRCC患者4例。3例腎癌標本于腎癌根治術后0.5 h內置于液氮罐凍存備用,1例正常腎組織標本取自T1期腎癌距原發灶5 cm以上的正常區域腎組織。所有標本均經常規病理檢查證實。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、熒光標記及cDNA的合成分別取上述各組織樣品50～100mg,用Trizol提取法提取總RNA,測定濃度并進行質量鑒定。用Low Input RNA Fluorescent Linear Amp lification Kit試劑盒將提取合格的RNA進行雙色熒光標記。4個標本各取總RNA 2μg,按照常規逆轉錄方法合成cDNA。

1.2.2 熒光標記cRNA的合成與純化 用Cy3標記腫瘤組織,Cy5標記正常腎組織,進行cRNA的合成。將cRNA樣品轉移到RNeasy微型純化柱, 13 000 r/min離心30 s,棄濾液;向柱子中加500μl的RPE緩沖液,13 000 r/min離心60 s,棄濾液。將純化柱轉移到新的收集管,在純化柱濾膜中央加入30μl的無RNA酶水,室溫放置60 s,13 000 r/min離心30 s,收集到約60μl的cRNA純化液,測定樣品濃度后,-80℃遮光貯存,備芯片雜交用。

1.2.3 芯片雜交、洗片和掃描 取以Cy3及Cy5標記的線性擴增cRNA各0.75μg混合,50μl的10×對照質控樣品,用去核酸酶水調至 215μl,混勻, -80℃避光保存。2×cRNA中加入9.0μl的25×片段化緩沖液,輕輕混勻,60℃避光孵育30m in后,加入 225μl的 2×雜交緩沖溶液,輕輕混勻,離心沉淀。取一新蓋玻片,標簽面向上置于雜交盒底座,在蓋玻片上滴加400μl雜交標本,將Agilent Human 1B寡核甘酸芯片數字面向上蓋在蓋玻片上。組裝好雜交盒,于雜交爐中60℃、4 r/min雜交16 h。取出芯片,置于洗液 1中,將芯片與蓋玻片分開,漂洗后取出,置入新的洗液1中室溫漂洗10 min,洗液2漂洗 5 min,氮氣吹干,遮光保存。將芯片置于Agilent2565BA基因芯片掃描儀中掃描,參數設置采用掃描儀的默認參數,掃描后的數據用Feature extraction軟件進行分析及均一化處理。

1.2.4 共同差異表達基因的判斷 以Cy3(gprocessedsignal)以及Cy5(rprocessedsignal)LogRatio P Value為標準進行判斷,若P＜0.01則認為該基因在疾病初診或復發時的表達存在差異,gprocessedsignal＜rprocessedsignal則界定為基因表達上調, gprocessedsignal＞rprocessedsignal則界定為基因表達下調。3例ccRCC患者中每1例復發時均表達上調的基因為共同上調基因,均表達下調的基因為共同下調基因,共同差異表達基因包括共同上調基因和共同下調基因。

2 結果

2.1 RNA質檢結果 3例癌組織和1例正常腎組織總RNA的A260/A 280為1.7～1.9,總RNA的電泳帶18 s和28 s均清晰,表明核酸成分完整,無降解,無蛋白質和有機溶劑等污染。經Agilent2100生物分析儀測定,曲線標準,符合實驗要求。

2.2 芯片雜交質控結果 2張芯片雜交結果經Feature extraction軟件嚴格篩選,芯片中全部22 000個點中有效雜交達99%以上。

2.3 正常腎組織和腎癌組織的基因表達譜差異比較 將3例癌組織的基因表達譜分別與正常腎組織的基因表達譜進行對比。結果顯示,1例上調基因 403個、下調基因 399個,1例上調基因 1 783個、下調基因 2 415個,1例上調基因 2 756個、下調基因 3 307個;3例癌組織與正常組織比較,共篩選出差異表達基因 204個,其中共同上調基因 31個(占15.2%)、共同下調基因173個(占84.8%),其中包括6個尚未被Genebank收錄的人類新基因。

3 討論

腫瘤的發生發展通常需要多個癌基因的激活,以及抑癌基因和細胞增殖、分化、凋亡等相關基因的協同作用。我們采用長鏈寡核苷酸基因芯片檢測ccRCC組織的基因表達譜,共發現差異表達基因204個,上調的基因 31個,下調的基因 173個。從基因的功能分類看,這些差異表達的基因主要包括癌基因、抑癌基因和細胞信號傳導、細胞周期、DNA轉錄翻譯、凋亡、細胞因子、代謝酶類等編碼基因。

本研究發現的 204個差異表達基因,除去 6個新基因及 11個編碼但功能不明確的基因,其余均可根據Genebank精確定位,確定其所在的染色體區帶及功能。從本實驗差異表達的基因的染色體定位情況分析,上調基因主要分布在 2p、3p、5q、9p、10q、11p、14q、20q等,而下調的基因主要分布在 1q、1p、3q、3p、4p、7p、11p、12q、13q、14q、17p和19p等,與以往的研究結果比較接近[1]。說明 ccRCC的發生與染色體的異常相關,差異表達基因較集中地分布在染色體的一定區帶上。統計發現,位于 3p、14q、5q的分別有13、9、6個差異表達基因,分別占 7.0% (13/187)、4.8%(9/187)、3.2%(6/187),屬于比較集中的幾個區域,3p區的 13個差異表達基因中有大家熟悉的VHL基因。VHL基因定位于染色體3p25～p26,其編碼的蛋白產物為pVHL,pVHL與細胞周期調控、細胞間信號傳導、細胞外纖維連接、蛋白形成及血管形成等腫瘤發生發展相關的生物學過程密切相關[2]。研究[1,3]表明,ccRCC患者 3p雜合性缺失、VHL基因突變以及甲基化所致VHL基因失活是原發性散發ccRCC發生的主要分子機制之一,而ccRCC患者中VHL基因突變率高達57%。據此,有學者提出,根據ccRCC基因表達譜的表達情況,將ccRCC進一步分成VHL突變陽性型和陰性型兩類。

本實驗結果顯示,包括原癌基因EGFR和抑癌基因VHL在內的諸多重要基因均呈顯著差異表達,其中EGFR和VHL的平均Ra值分別為15.01和0.04,即分別上調 15倍和下調 25倍,HIF-1α平均Ra值為28.00,上調28倍。VHL、HIF-1α和EGFR等這些基因的明顯差異表達,揭示其與ccRCC的發生密切相關,這一點已普遍地被人們接受[3]。

目前大多數研究者[4]認為,ccRCC的發生與染色體的異常相關。如 1、3、5、6、9、13、14號染色體的部分缺失或擴增,其中單一染色體異常較多見的是3號染色體。據統計,3號染色體或 3p的缺失異常約占 60%,此外還包括 14q的缺失和 5q的放大。Chen等[5]用SNP芯片檢測80例ccRCC組織,發現最易出現雜合性丟失的是 3p,共有 69例(占86.25%),其次是 8p12、6q23.3-27、14q24、9q32、10q22等;出現 5q異常擴增的有 32例。Arai等[6]通過對51例ccRCC組織基因聚類分析,也發現3p的缺失和 5q的擴增是最常見的染色體異常。

[1]Beroukhim R,Brunet JP,Di Napoli A,et al.Patterns of gene expression and copy-number alterations in von-hippel lindau diseaseassociated and sporadic clear cell carcinoma of the kidney[J]. Cancer Res,2009,69(11)：4674-4681.

[2]Pause A,Peterson B,Schaffar G,et al.Studying interactions of four proteins in the yeast two-hybrid system：structural resemblance ofthe pVHL/elongin BC/hCUL-2 complex with the ubiquitin ligasecomplex SKP1/cullin/F2 box protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(9)：9533-9538.

[3]果宏峰,龔侃,鄒霜梅,等.腎透明細胞癌中VHL基因突變與缺氧誘導因子-1α表達的研究[J].中華泌尿外科雜志,2004,42 (11)：196-200.

[4]Monzon FA,Alvarez K,Gatalica Z,et al.Detection of chromosomal aberrations in renal tumors：a comparative study of conventional cytogenetics and virtual karyotyping with single-nucleotide polymorphism microarrays[J].Arch Pathol Lab Med,2009,133(12)：1917-1922.

[5]Chen M,Ye Y,Yang H,et al.Genome-wide profiling of chromosomal alterations in renal cell carcinoma using high-density single nucleotide polymorphism arrays[J].Int JCancer,2009,125(10)：2342-2348.

[6]Arai E,Ushijima S,Tsuda H,et al.Genetic clustering of clear cell renal cell carcinoma based on array-comparative genomic hybridization：itsassociation with DNAmethylation alteration and patient outcome[J].Clin Cancer Res,2008,14(17)：5531-5539.