PCR-RFLP和微衛星DNA標記法在棘球絳蟲感染診斷中的應用

劉春燕,馬秀敏,丁劍冰,諶宏鳴

(新疆醫科大學高職學院,烏魯木齊 830006)

包蟲病是棘球絳蟲的幼蟲寄生于人及某些動物等宿主體內所致的一種嚴重的人畜共患性疾病。在不同的宿主中,棘球絳蟲存在著實質性的基因遺傳差異,為此采用基因診斷方法具有重要的診斷價值[1]。本研究采用PCR-RFLP和微衛星DNA標記法對包蟲病棘球絳蟲分離株的基因型進行鑒定,希望為棘球絳蟲的實驗室診斷尋找一種快速有效分子生物學檢測方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源 40個包囊標本來自 40例包蟲病患者(男 22例、女 18例,年齡 18～65歲,漢族 32例、蒙古族5例、回族2例、維吾爾族1例)。無菌取囊組織,用生理鹽水漂洗后加入 95%的乙醇保存,以 1個包囊為 1個分離株。

1.2 引物合成 PCR-RFLP方法：在Genebank中查詢棘球絳蟲線粒體DNA基因序列,根據其他研究報道的基因序列,用DNAman軟件輔助設計上、下游引物。rrnl上游引物為5′-GGTTTATTTGCCCCGCATCATGC-3′,下游引物為5′-ATCACGTCAAACCATTCAAACAAGC-3′,擴增長度為561 bp。微衛星DNA標記法：參照文獻和檢索Genebank中棘球絳蟲微衛星位點,設計棘球絳蟲微衛星位點基因引物,正向引物5′端分別標記不同顯色的熒光。Sea上游引物為5′-CGAAAGTGATGACAAACCAA-3′,下游引物為5′-CGTTGATGGAGATGAGGTCG-3′,擴增長度為561 bp。兩組引物由日本Genosys公司合成并標記。

1.3 DNA的提取 取包蟲病患者的包囊組織約25 mg,置培養皿中,漂洗 2遍后放入離心管中,嚴格按DNA提取試劑盒說明書操作,提取基因組DNA。

1.4 PCR擴增 PCR-RFLP方法：以棘球絳蟲DNA為模板,加入引物,按常規方法擴增基因片段。擴增參數：94℃預變性2 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1min,35個循環;72℃延伸2 min。每次反應均設立不含DNA模板的陰性對照和已知棘球絳蟲DNA的陽性對照。微衛星DNA標記法：以提取的棘球絳蟲DNA為模板,加入熒光引物,按常規方法擴增棘球絳蟲三位點微衛星序列。擴增參數：94℃、1mim,94℃、30 s,55℃、30 s,72℃、30 s, 35個循環;72℃延伸5 min。每次反應均設立不含DNA模板的陰性對照和已知棘球絳蟲DNA模板的陽性對照。

1.5 數據分析 采用GeneSean5.1軟件進行電泳圖象掃描和收集分析DNA片段,結合Genotype軟件分析收集的數據進行基因分型。

2 結果

以棘球絳蟲DNA為模板,用特異性引物進行PCR擴增,可得到大小約為561 bp的擴增條帶,產物的長度與引物設計的預期產物長度一致,且條帶清晰。以棘球絳蟲DNA為模板,用Sea引物進行PCR擴增,可得到約90 bp的擴增條帶,產物的長度與引物設計的預期產物長度一致,且條帶清晰,說明PCR產物可信,可用來進行基因掃描。40個分離株標本經熒光PCR及微衛星標記鑒定均為細粒棘球絳蟲,其中 39個細粒棘球絳蟲分離株標本為細粒棘球絳蟲 G1基因型,1個分離株標本為細粒棘球絳蟲G6基因型。熒光 PCR及微衛星標記鑒定結果與DNA序列分析基因型結果完全一致。

3 討論

棘球絳蟲屬于扁形動物門的絳蟲綱,其成蟲寄生于犬科肉食動物小腸內,呈扁平帶狀小型寄生蟲,幼蟲寄生于人或其他動物的肝、肺等器官中引起囊型包蟲病[2]。棘球絳蟲呈世界性分布,由于其由大量內部變異的蟲株組成,在不同的地理環境和宿主中,棘球絳蟲的蟲株不同,對人群的傳播動力學、致病性、抗原反應、化療反應等不同。因此,對棘球絳蟲蟲株的鑒定及種內變異性的研究,可指導包蟲病的診斷、抗包蟲病藥物的選擇、疫苗的研制等[3]。已發現棘球絳蟲感染與犬腸內局部升高的免疫力之間有關聯,有研究通過對新疆家犬小腸內棘球絳蟲的大體觀察及DNA檢測,發現家犬存在棘球絳蟲和多房棘球絳蟲混合感染[4]。

微衛星DNA是新近發現的一種DNA遺傳學標志,具有易于篩選、種類繁多、分布廣泛、高度多態性、重組率低和在種群中表現出高度的個體特異性等特點。熒光PCR結合基因掃描基因分型法更加快速準確,實現了全部操作自動化,方法簡單易行,需要的擴增產物量少、靈敏度高、重復性好、信息量大,適用于大規模群體遺傳學研究及流行病學調查[5]。本研究以棘球絳蟲的Sca微衛星序列為分型標記,利用熒光PCR基因掃描技術鑒定包蟲病患者棘球絳蟲分離株的基因型和雜合度,多個微衛星標志聯合分析可提高基因分型的鑒別力。純合子的PCR產物由相同堿基序列的DNA片段組成,而雜合子的PCR產物則包括兩種不同長度的DNA片段,長度差異由核心序列的不同串聯重復數引起,通過精確測定PCR產物長度就能確定微衛星基因型[6]。本實驗結果表明,39個細粒棘球絳蟲分離株標本為細粒棘球絳蟲 G1基因型,1個分離株標本為細粒棘球絳蟲G6基因型,微衛星標記鑒定結果與DNA基因型序列分析結果一致。在本研究中未發現棘球絳蟲的雜和現象,可能是棘球絳蟲大多為自體受精,發生雜合現象的機會較少所致。

隨著寄生蟲分子遺傳學的發展,現已從研究細粒棘球絳蟲的表型發展到研究其基因型。PCRRFLP以其簡單、敏感、可靠、價廉、所需樣品量少、無需同位素等優點為研究者們所接受[7]。本研究采用PCR-RFLP擴增棘球絳蟲rrnl基因序列,該序列長度為561 bp。PCR-RFLP對棘球絳蟲的基因型鑒別與DNA序列分析鑒別結果符合率達100%。

總之,PCR-RFLP方法和微衛星DNA標記法是簡單、快速、有效的棘球絳蟲基因型檢測診斷方法。但其在寄生蟲學方面的應用目前還處于初始階段。

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